Promega：Georgyi V. Los, Ph.D., Chad Zimprich, B.S., Natasha Karassina, M.S., Randall Leaderish, Ph.D., Lance P. Encell, Ph.D., Rachel Friedman-Ohana, Ph.D., Monica Wood, M.S., Gediminas Vidugiris, Ph.D., Kris Zimmerman, B.S., Keith Wood, Ph.D.Promega Biosciences：Mark G. McDougall, Ph.D., Dieter H. Klaubert,Ph.D.

摘 要

HaloTag™可互换标记技术，为针对活细胞及体外实验中进行蛋白的快速的位点特异性标记提供了新的选择。该技术的基础是HaloTag™蛋白与合成的配基间形成共价键。在生理条件下这种共价键特异性高，不可逆，形成快速，生成的复合物稳定性强，甚至在变性条件下也能如此。这种HaloTag™ 配基可以承载多种功能，包括荧光标记，亲和处理及固相吸附。HaloTag™ 配基的可互换性使得不用改变基本的遗传结构就可在不同的波长下进行细胞成像或结合新的功能团。标记的HaloTag™ 融合蛋白具有多种功能和较宽的光学检测范围。该灵活性使得研究人员可以在活细胞或固定细胞中对标记的HaloTag™ 融合蛋白进行成像和定位。同样也可用于分离和分析HaloTag™ 融合蛋白和蛋白复合物。

HaloTag™ 配基的可互换性有助于在不同波长下成像，也可以在不改变基因序列的前提下引入新的功能

简 介

能否特异性地标记蛋白是揭示活细胞动力学和功能的关键（1）。然而，许多用来生成自然状态下的荧光标记蛋白并对其成像的传统方法既费时又困难，要求研究者精于蛋白质化学，能成功地将标记产物注射于细胞内。这需要高度的专业技术和设备支持（2）；另一方面，通过克隆和转染细胞获得的全程合成蛋白的技术更易于研究蛋白定位的本来面目，用基因融合技术标记蛋白的新方法使我们能够更加了解细胞的功能。这里我们详细描述了最新的HaloTag™ 可互换标记技术——一种在活细胞和体外培养条件下都可将融合蛋白有效标记的灵活系统。

HaloTag™ 可互换标记技术概述

图1提供了一个HaloTag™ 标记策略的概览。首先，将编码HaloTagTM蛋白或融合蛋白的HaloTag™ pHT2载体导入到细胞内。现已有多种标准方法，既可用于表达HaloTag™ 细胞系的瞬时转染，也可以产生表达HaloTag™ 蛋白的稳定细胞系。然后，细胞与5-25μM相应配基孵育5-60分钟。HaloTag™ 配基穿过细胞膜，与HaloTag™ 蛋白共价结合。洗掉未结合的配基后，研究人员即可按预定方案来实施他们的计划：荧光成像（活细胞成像或固定细胞成像），细胞裂解及蛋白捕获，或凝胶分析。荧光配基的可互换性使得人们可以在不改变基因序列的情况下在不同波长下成像或结合新的功能团。HaloTag™ 可互换标记技术操作手册（HaloTag™ Interchangeable Technology Technical Manual）(TM260）给出了详细的操作流程。

图1.HaloTag™ 可互换标记技术概览

HaloTag™ 可互换标记技术的组成

HaloTag™ 蛋白不具有催化能力，它是一种蛋白水解酶的遗传修饰衍生物，可与多种HaloTag™ 配基形成有效的共价结合（图2）。这种33kDa的单体蛋白可用于生成N－或C－端融合蛋白，这些融合蛋白可在多种类型的细胞中表达。由于HaloTag™ 蛋白源于原核细胞，哺乳动物细胞内不存在具有该蛋白活性的内源性蛋白。HaloTag™ pHT2载体包括：CMV增强子/启动子，可在许多细胞系内启动强烈而稳定的表达；一个嵌入的内含子，用于减少隐蔽的剪接位点；T7启动子，用于体外转录和/或翻译系统；以及SV40晚期poly A信号。

图2:HaloTag™ 蛋白与HaloTag™ TMR配基共价结合的分子模式.右上图为蛋白结构概况,在下是以网状Connolly表面模拟的配基结合部位的放大图。HaloTag™ TMR配基（红色的为功能区，桔色的为反应连接部位）。蓝色的为天冬氨酸亲核基团，与该配基共价结合。以苯丙氨酸残基（蓝色）替代催化部位（组氨酸），使得HaloTag™蛋白的催化能力失活，因为这样破坏了其水解酯类中间体最终形成稳定的共价键的能力。

图3.HaloTag™配基的结构。缩写:TMR,tetramethyl-rhodamine.diAcFAM,diacetyl-flurescein。

图4.荧光偏振(FP)分析比较HaloTag™ 配基和链亲和素-生物素实时检测。检测在Beacon 2000仪器上进行。所得数据用来计算二级速率常数（3）。Qureshi et al.(4)已报道链亲和素-生物素的速率为5.0×106M-1sec-1 。

HaloTag™ 配基是一些小的化合物标签，它们能与HaloTag™ 蛋白共价结合。这些配基包含两种关键成分：1）一个通用的HaloTag™反应连接部位，其作用是启动与HaloTag™蛋白的共价键的形成;2)一个功能报告基团，如荧光染料TMR和diAcFAM，或亲和反应基团如生物素（图3）。HaloTag™配基结合到HaloTag™蛋白的速度是极快的。使用纯化的GST－HaloTag™蛋白融合的荧光偏振分析显示，体外实验中HaloTag™ TMR配基结合的速度很快，其结合动力学与实时测量的TMR－生物素结合链亲和素的动力学相似（图4）。其速度也与已报道的生物素－链亲和素的结合速度相似（4）。在技术手册 TM260描述的标记条件下，HaloTag™ TMR，diAcFAM 和生物素配基没有有可检测到的细胞毒性，对细胞形态也无不良影响。

活的和固定的哺乳动物细胞成像

如图5所示，表达HaloTag™蛋白的细胞被HaloTag™ TMR或HaloTag™ diAcFAM 配基标记后，荧光强度很高。与此对比，在相同成像条件下，对照细胞由于缺少 HaloTag™ 蛋白，则检测不出荧光。这些结果证明以这种方法标记细胞具有很高的特异性，同时也显示了两种配基均对活体细胞成像有效。优异的荧光信号的信噪比，使得可以在相对较低的表达水平下，检测出所表达的蛋白。

图5. 表达HaloTag™ 蛋白的活细胞被HaloTag™ TMR或HaloTag™ diAcFAM配基所标记而得到的强荧光影像。A，B，E，F为瞬时转染了HaloTag™ pHT2载体的HeLa细胞，C，D，G，H为对照细胞。A到D为标记了5μM HaloTag™ TMR配基，E到H为标记了10μM HaloTag™ diAcFAM配基，均37℃孵育15分钟。使用适当的TMR和FAM滤过或透光装置，在Olympus FV500共聚焦显微镜下获得以上影像。

HaloTag™ 蛋白和与其配基之间共价结合的稳定性，使得对固定细胞的成像变得很容易。用HaloTag™ TMR 或 HaloTag™ diAcFAM 配基标记表达 HaloTag™ 蛋白的HeLa细胞。转染细胞在固定之后保持明亮的荧光(图6)。而对照细胞即使经过配基处理也没有可测定的荧光。荧光信号对细胞固定剂的耐受使得HaloTag™技术与其它免疫细胞化学技术和免疫组织化学技术共用成为可能。此外，对固定细胞成像的技术，对希望通过自动扫描技术进行大量细胞分析来说是至关重要的，比如高容量分析。

图6. 表达HaloTag™ 蛋白的固定细胞被HaloTag™ TMR或HaloTag™ diAcFAM配基所标记而得到的强荧光影像。A，B，E，F为瞬时转染了HaloTag™ pHT2载体的HeLa细胞，C，D，G，H为对照细胞。A到D为标记了5μM HaloTag™ TMR配基，E到H为标记了10μM HaloTag™ diAcFAM配基，操作参照图1的规程。细胞以3.7%的多聚甲醛固定，使用适当的TMR和FAM滤过或透光装置，在Olympus FV500共聚焦显微镜下获得以上影像（图B，D，F，H）。

活细胞中被标记的HaloTagTM 融合蛋白的凝胶分析

HaloTag™ 蛋白—配基的相互作用非常稳定。荧光标记的 HaloTag™ 蛋白能与SDS样品缓冲液一起煮沸，并且经SDS－PAGE 凝胶电泳分离后，没有可测定的荧光信号损失。当需要把活细胞标记技术与SDS-PAGE及荧光成像分析技术结合在一起时，这种特性就显得尤为重要。

通过将瞬时表达HaloTag™蛋白的CHO-K1细胞与HaloTag™ TMR 配基一起孵育以研究结合的时间进程。通过SDS－PAGE凝胶电泳分析细胞裂解产物，结果显示了与HaloTag™ 蛋白质的分子量相当的单一荧光带。在短至5分钟的时间里，活细胞内所有有效的 HaloTag™结合位点都被标记。不过这仍然比在体外实验(图4) 中观察到的速率慢了很多。这可能预示配基通过细胞膜是限速步骤。细胞到凝胶电泳直接分析标记的HaloTag™融合蛋白的技术，可以结合其它蛋白分析方法，例如Western Blot。我们的初步数据也显示，这一方法可以成功地用于研究以HaloTag™融合蛋白为基础的翻译后修饰(如蛋白酶水解，资料未显示)。

HaloTag™ 融合蛋白的捕获

使用含有亲和臂的配基，HaloTag™ 标记技术可被用来捕获哺乳动物细胞中表达的 HaloTag™ 融合蛋白。依照TM260技术手册中描述的程序，将海肾（Renilla）萤光素酶- HaloTag™ – FLAG的载体瞬时转染到CHO- K1细胞，再把该细胞与HaloTag™ 生物素配基一起孵育，对照组中无HaloTag™ 生物素配基。各组细胞裂解物与包被有链亲和素的MagneSphere? 顺磁性颗粒(Cat.# Z5481)一起孵育，以捕获生物素标记的融合蛋白。蛋白经过 SDS－PAGE凝胶电泳分离，并使用抗-FLAG抗体对其进行Western Blot 分析。正如预期的那样，经过配基处理的细胞和对照细胞均表达了海肾（Renilla）萤光素酶-HaloTag™-FLAG蛋白（图7A，泳道1和4）。然而只有与配基处理过的细胞胞质共育的磁珠，能够捕获海肾（Renilla）萤光素酶-HaloTag™- FLAG蛋白（图7A，泳道3和6）。重要的是，在磁珠上捕获的融合蛋白仍保留海肾（Renilla）萤光素酶的活性（图7B）。

图7. 包被有链亲和素的磁颗粒对HaloTag™ 融合蛋白的有效捕获。CHO-K1细胞瞬时转染HaloTag™ pHT2载体，该载体编码Renilla荧光素酶-HaloTag™ –FLAG融合蛋白。细胞在无HaloTag™ 生物素配基和有该配基条件下（5μM或25μM，15分钟，37℃）培养。细胞被裂解，生物素标记蛋白被链亲和素包被的磁颗粒（Cat.# Z5481）捕获。图7A：以抗-FLAG抗体M2（Sigma）做Western blot分析。泳道1，细胞裂解液（+配基）；泳道2，未结合的蛋白（+配基）；泳道3，结合的蛋白（+配基）；泳道4，细胞裂解液（-配基）；泳道5，未结合的蛋白（-配基）；泳道6，结合的蛋白（-配基）。图7B：使用Renilla荧光素酶底物（Part#E289B）来检测捕获的荧光素酶的活性。仪器为Orion Microplate 发光检测仪 (Berthold检测系统)。

结论：

HaloTag™ 可互换标记技术用于活细胞和体外实验中产生具有宽谱光学特性和功能的标记蛋白。这种新技术可以用来成像活的或固定哺乳动物细胞，允许使用者监测 HaloTag™ 融合蛋白在细胞内部的迁移，观察亚细胞结构或蛋白更新周期。该技术也可以采用 SDS-PAGE 电泳（细胞到凝胶）分析，来检测各种翻译后事件，或是直接从活细胞，或体外转录/翻译反应中，通过固相载体捕获HaloTag™ 融合蛋白和蛋白复合物。因此该系统可以方便地应用于不同的细胞系和生物体，从而提供一种通用的、完整的实验方法，用于蛋白和蛋白功能研究。

参考文献
1． Giuliamo, K.A. and Taylor, D.L. (1998) Trends Biotechnol. 16, 135-140.
2． Chapman-Smith, A. and Cronan, J.E. (1999) Trends Biochem. Sci. 24, 359-63.
3． Cornish-Bowden. (1995) In: Fundamentals of Enzyme Kinetics, pp. 1-17.
4． Qureshi, M.H. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 46422-8.

技术手册下载：
详见 Promega 公司 HaloTag™ Interchangeble Labeling Technical 的技术手册#TM260:HaloTag® Technology: Focus on Imaging .

HaloTag® Technology: Focus on Imaging

All technical literature is available on the Internet at: www.promega.com/tbs/ Please visit the web site to verify that you are using the most current version of this Technical Manual. Please contact Promega Technical Services if you have questions on use of this system. E-mail: techserv@promega.com.

1. Description..........................................................................................................2
A. Overview and Advantages of HaloTag® Technology ....................................3
B. The HaloTag® Ligands.........................................................................................3
C. The HaloTag® Vectors .........................................................................................6
2. Product Components and Storage Conditions ............................................8
3. Cell-Based HaloTag® Protocols.......................................................................9
A. Preparation of Cultured Cells Prior to Labeling .............................................9
B. Live-Cell Imaging (Rapid Labeling)................................................................10
C. “No-Wash” Protocol for Standard and High-Content Imaging .................12
D. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS®)................................................14
E. Fixed-Cell Imaging.............................................................................................16
F. Immunocytochemistry Using the Anti-HaloTag® pAb................................18
4. SDS-PAGE Analysis of HaloTag® Protein Fusions..................................20
5. Troubleshooting...............................................................................................21
6. Appendix ...........................................................................................................24
A. HaloTag® Flexi® Vectors....................................................................................24
B. HaloTag® Technology and Chemistry ............................................................25
C. Tips and Considerations....................................................................................26
D. Composition of Buffers and Solutions ............................................................28
E. Literature Cited...................................................................................................28
F. Peer-Reviewed Papers Citing HaloTag® Technology...................................28
G. Related Products.................................................................................................29

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