Proemga公司：Aileen Paguio, M.S., Brain Almond, Ph.D., Pete Stecha, B.S., Denise Garvin, M.S., Monica Wood, M.S., Keith Wood, Ph.D.

摘要

报告基因技术是了解基因表达和调控的有力工具（1，2），用于哺乳动物细胞的报告基因中，萤光素酶因其高度灵敏、灵活、易定量、易检测的特性受到好评（3）。我们现在设计并开发了几种用于萤火虫和海肾（Renilla）萤光素酶的新型的报告基因载体，可用于从细胞生物学中转录活性检测到药物开发高通量筛选等。该载体提高了报告基因的表达量，降低了本底并具有更快的转录动力学应答。该载体的设计也减少了异常表达的风险。

我们的目标是创造一种理想的报告基因载体：
1. 在宿主细胞中的表达是一致性的和最佳的
2. 使非目的应答最小化（减少异常表达）
3. 对转录动力学应答灵敏

简介

我们已经开发了一系列新的报告基因载体：pGL4萤光素酶报告基因载体。在设计这些载体时，我们的目标就是创造一种理想的报告基因载体，它满足下列条件：1.在宿主细胞中的表达是一致性的和最佳的；2.使非目的应答最小化（减少异常表达）；3.对转录动力学反应灵敏。

为了进一步改善源于天然萤光素酶的报告基因的性质，我们制定了如下三个原则：第一，采用优选的哺乳动物序列的表达密码，以增加萤光素酶报告基因在哺乳动物细胞中的表达水平（4，5）。第二，去掉了隐性调节序列，以减少异常表达（4，6－8）。最后，发展了去稳定萤光素酶基因(报告基因的快速应答)，具有比天然萤光素酶快得多的应答速度（9）。

用来向宿主细胞呈递报告基因的载体对于整个报告基因分析实验也是非常关键的。载体上的隐性调节基因如转录因子结合位点和/或启动子序列能造成高背景和不规则的应答（10，11）。虽然对于所有哺乳动物细胞报告基因载体来说，这是一个普遍问题。此前，在解决这些问题方面做得很少。我们对于整个载体骨架实行“清洁”策略，尽可能去掉隐性调节序列，同时保持原有功能。除了重新设计载体的骨架外,载体结合了不同的特征，如萤光素酶的选择，包括Rapid Response™ 版本的报告基因，无启动子（基本型）和含启动子（对照）型载体。表1描述了pGL4萤光素酶报告基因载体的十个成员。图1显示了pGL4载体的示意图。

图1.pGL4 10[luc2]载体

减少异常表达的风险

pGL4载体的骨架模板就是pGL3载体的骨架。在pGL3载体骨架上，存在大量的共有转录因子结合位点（图2）。为了减少异常表达的风险并增加报告基因表达的可信性，我们重新设计了pGL3载体中从报告基因起始点到细菌的复制序列的起点，以减少共有转录因子结合位点的数量，从而降低异常表达的风险（图2）。其它的修饰包括重新设计多克隆位点，去除f1复制起始点，去除一个内含子序列及减少启动子的数量（启动子是调节元件，包括两个或更多的被间隔序列分开的转录因子结合位点）。合成的poly(A)信号/转录中止位点保留了多克隆位点（无启动子的载体）或哺乳动物细胞启动子（含启动子的载体）的上游。细菌的复制起始点和报告基因的SV40晚期poly(A)信号下游没有被修饰。

尽管DNA序列经过了重大改变，但新设计的pGL4载体的复制条件在E.coli中的筛选及培养都与pGL3相似。

改善萤光素酶的表达

pGL4载体也具有一个改良的萤火虫萤光素酶基因，luc2。与其前身相比（pGL3载体中的luc+）, luc2进行了密码子的优化并具有更少的隐性调控序列（图3）。通过改变在哺乳动物细胞中最常用的密码子，同时去除大多数转录因子的共有结合位点，luc+萤光素酶基因被重新设计合成。另外，在luc2基因中，预计的启动子单元的数量也被减为一个。

在图4中显示的转染实验中，合成的萤火虫萤光素酶基因luc2，显示出其相对于luc+的表达量的增加。为了确认合成的结构仅影响表达，luc+和luc2基因均分别克隆入pGL3对照载体。载体与对照共转染24小时后，以对照为基础，测定相对萤光单位。比较luc+和luc2基因，证实检测的4个哺乳动物细胞系中，luc2的表达量有4.1到11.8倍的增加。

图4. 萤火虫luc2 基因显示比luc+具有更高的表达。luc2 基因被克隆到 pGL3-control载体内(Cat.# E1741),替换了luc+基因。这样，两种萤火虫萤光素酶基因就在相同的pGL3-control载体的骨架上。包含其中任一种萤火虫萤光素酶基因的两个载体被转染到NIH/3T3，CHO，HEK 293和HeLa细胞内，使用 phRL-TK载体（Cat.# E6241）作为转染对照。转染24小时后，使用Passive Lysis Buffer（Cat.# E1941），对转染后的细胞进行裂解，使用双萤光素酶检测系统（Cat.# E1910）测定发光强度。相对发光强度为经过与phRL-TK载体对照转染细胞的海肾（Renilla）萤光素酶表达的标准化处理。柱状图上给出了（luc2和luc+）表达值之间的倍数关系。

改善的信噪比

修饰了的pGL4载体骨架结合合成的报告基因后，与对应的pGL3和phRL载体相比，信噪比有很好的改善。表2给出了这些载体与它们相应的无启动子载体的对比，以及信噪比增加的百分数。在表格的下面，显示pGL4.13[luc2/SV40]载体的信噪比增加373％，信噪比增加最多的是pGL4.75[hRluc/CMW]载体，达6388%。

载体间容易转移

pGL4 载体的另一个特征是重新设计了多克隆区，使得启动子以及其它转录元件在pGL4 载体系列之间，或从pGL3到pGL4载体间易于转移(图5)。新的多克隆区保留了大部分pGL3载体的主要限制性内切酶的位点,但在新的多克隆区的两端引入了两个Sfi I位点(Sfi I可以识别DNA序列GGCCNNNNNGGCC，N可以是A，T，G或C)。每个位点产生独特的粘末端。这一性质允许元件（没有内部Sfi I位点）的定向转移：经过简单的Sfi I消化，从一个pGL4载体的多克隆区转移到另一个载体。

图5. pGL4 载体的多克隆区。 图中，Bgl I和EcoR V位点在hRluc基因中也存在，因而不应该用于基于hRluc－海肾(Renilla)的pGL4载体的克隆。

结论

pGL4载体系列代表了新一代萤光素酶报告基因载体，有多种基因和启动子配置供用户选择。与它的前一代产品pGL3载体相比，pGL4载体减少了异常表达的风险,能够实现较好的萤光素酶表达，提高了信噪比。这些特点，加之它很容易在载体之间转移，使得pGL4成为萤光素酶报告基因载体最好的选择。

编者备注: Promega 正在研制其它pGL4载体，以满足研究人员在报告基因方面的需求，包括含有可选标记的载体。 请继续关注Promega在2005年关于pGL4报告基因载体方面发布的新消息。

参考文献
1. Wood, K.V. (1995) Curr. Biol. 6, 50-8
2. Naylor, L.H. (1999) Biochem. Pharmacol. 58, 749-57
3. Wood, K.V. (2004) Progress in Biomedical Optics and Imaging, Nicolau, D.V. and Raghavachari,R.,eds. SPIE-The International Society for Optical Engineering,Bellingham, 66-67.
4. Zhang, Y. et al. (2001) Promega Notes 79, 6-11.
5. Almond, B. et al. (2003) Promega Notes 85, 11-4.
6. Annicott, J.S. et al. (2001) Bio Techniques 31, 993-4
7. Ho, C.K.M. and Nordeen, S.K. (1999) BMC Biotechnology 4, 10
8. Grimm, S.L. and Strauss, J.F. (2004) Bio Techniques 27, 220-2
9. Almond,B. et al. (2004) Promega Notes 87, 18-22
10. Bert, A.G. et.al. (2000) Plasmid 44, 173-82
11. Thirunavukkarasu, K. et al. (2000) Bio Techniques 28, 506-10

技术手册：
pGL4 Luciferase Reporter Vectors Technical Manual #TM259.
www.promega.com/tbs/tm259/tm259.html

pGL4 Luciferase Reporter Vectors

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1. Description.................................................................................................................................1
2. Product Components and Storage Conditions ....................................................................3
3. General Considerations............................................................................................................4
A. The pGL4 Vector Backbone ............................................................................................4
B. The pGL4 Reporter Genes ..............................................................................................6
C. Distinguishing Features of the pGL4 Vectors..............................................................7
D. Common Features of the pGL4 Vectors .....................................................................17
4. pGL4 Vector Sequences, Restriction Enzyme Tables and Maps ..................................18
5. References ................................................................................................................................20
6. Related Products ......................................................................................................................21

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