HisTrap FF crude Columns/ HisTrap FF crude Kit-对非澄清裂解物中方便纯化

HisTrap FF crude 1 ml 和5ml 预装柱内预装了Ni sepharose 6 FF，可以直接用来上样未澄清的细胞裂解液， 可以快速方便的纯化有组氨酸标签的蛋白。细胞碎片和经过匀浆的颗粒物质或经超声后的细胞裂解液可以上柱但不影响介质的结合能力和被纯化蛋白的纯度。这个可以减少样品的制备时间，加快纯化速度， 使在有蛋白酶存在的细胞裂解液中敏感的目标蛋白的降解的可能性降到最小。HisTrap FF crude kit 包括预装柱，预制好的方便添加和快速起步缓冲液。

HisTrap FF粗分离柱允许简单、一步纯化组氨酸标记蛋白质，无需经过离心和过滤等样品预处理。

优化适合从均质，非澄清细胞溶解物中纯化组氨酸标记蛋白。
简单匀浆，直接上样。
高结合容量，约40 mg/mL填料, 预充镍离子微量泄漏。
宽广范围的兼容还原剂、去垢剂、变性剂和其他添加剂。
方便试剂盒提供柱和缓冲液，快速简单纯化。
操作简单，可用注射器、泵或层析系统，如ÄKTAdesign或FPLC系统。

1 mL和5 mL HisTrap FF粗分离柱可方便地从均质、非澄清的细胞溶解物中简单、一步纯化组氨酸标记蛋白。非澄清样品直接上样，既可以节约时间又可以防止敏感目标蛋白降解。

HisTrap FF粗分离柱预装镍Sepharose 6 Fast Flow。为得到最好结果，我们建议首先使用溶菌酶和核酸酶DNAseⅠ进行酶解，然后用机械裂解，如超声波裂解法。均质样品可不经过澄清步骤直接上柱，可防止敏感目标蛋白降解和增加活性。

HisTrap FF粗分离试剂盒方便纯化组氨酸标记蛋白。HisTrap FF粗分离试剂盒包括3根1 mL HisTrap FF粗分离柱、磷酸盐缓冲液，pH7.4（2×50 mL [8×浓度]），2 M咪唑，pH7.4，所有必要的连接装置，一支注射器和说明书。

与常规IMAC相比，HisTrap FF粗分离柱在纯化组氨酸标记蛋白时更节省时间。

HisTrap FF crude 1 ml and 5 ml

HisTrapTM FF crude 是一种预带电荷的Ni SephroseTM 6 Fast Flow 即用的预装柱。该预装柱的目的是采用固定化金属配体亲和层析 (IMAC) 来纯化带有组氨酸标记的重组蛋白质。在细胞完全破碎后，样品无需预离心及过滤就可将未澄清的细胞裂解液上到柱上。为确保裂解完全，我们建议延长样品的机械处理时间。

Ni Sephrose 6 Fast Flow 具有低 (Ni2+) 离子脱落并与用于蛋白质纯化的许多添加剂相兼容。柱与介质的相结合的特殊设计提供了快速、简单、及方便的纯化。纯化时间的缩短通常使有害影响减到最少，例如，敏感的目标蛋白的降解和氧化，因此, 纯化时间的缩短极其重要。

HisTrap FF crude 可用注射器、恒流泵，或液相层析系统，如 ÄKTAdesignTM 层析系统或FPLCTM 系统的操作。

小心：含鎳。可能引起过敏反应。

1 说明
介质的性质
HisTRap FF crude 1-ml 和 5-ml 柱是用亲和介质Ni Sepharose 6 Fast Flow 的预装柱，由具有固定鳌合基团的高度交联的球状琼脂糖组成。该介质已预荷有Ni2＋离子电荷。几种氨基酸，例如，组氨酸能与许多金属离子形成复合物。如果适宜的形成复合物的氨基酸残基暴露在蛋白质的表面，Ni Sepharose 6 Fast Flow 选择性地与蛋白质结合。外加的组氨酸标记增加了与Ni2＋离子的亲和力，并通常使样品中标记组氨酸的蛋白质在其它蛋白质之中结合最强，例如，E. coli 裂解液。

柱的特性
HisTrap FF crude 专门用于制备纯化组氨酸标记的重组蛋白。在细胞完全破碎后，样品无需预离心和过滤，就可将未澄清的细胞裂解液上样到特殊设计的柱上。位于柱顶部和底部的滤器使超声裂解液直接上样到柱成为可能。经过优化的滤器孔径使得直接上柱的超声裂解液不会引起反压问题或Ni Sepharose 6 Fast Flow 珠的脱落。HisTrap FF crude 由与生物兼容的聚丙烯制成，这就不会与生物分子相互反应。随柱带有一个进口的塞子和一个出口的速变弹簧夹。柱的顶部和底部为多孔的烧结玻璃便于未澄清的细胞裂解液直接上柱。柱可用针筒注射器和提供的路厄氏接头、恒流泵、或用层析系统，如，ÄKTAdesighTM 或FPLCTM 系统来操作。

注意： HisTrap FF crude 柱不能打开及重装。
注意： 确保拧紧接头，防止泄漏。

2 一般事项
HisTrap FF crude 柱以预负Ni2＋离子电荷供应。通常，Ni2＋离子是纯化重组的组氨酸标记的蛋白的最佳金属离子。然而，请注意，在某些情况下最好试验其他的金属离子，例如，锌（Zn2＋）或钴 (Co2＋)，因为结合的强度取决于组氨酸标记的蛋白的属性以及金属离子（见第5 节，纯化效率的优化）。

我们建议在中性到略碱性 pH（pH7－8），0.5-1.0 M NaCl 存在下结合。通常使用磷酸钠缓冲液。Tris-HCl 也常被使用，但在金属－蛋白亲和力很弱情况下应避免使用，因为可能会降低结合强度。在缓冲液中应避免用鳌合剂，如，EDTA 或柠檬酸（见表2）。一般来说，用咪唑洗脱组氨酸标记的蛋白质。

在缓冲液和样品中含盐，如0.5-1.0 M NaCl，可以消除离子交换的影响，但也可能在蛋白的保持力上有边缘效应。

通常在结合和淋洗缓冲液中采用低浓度的咪唑来尽量减少宿主细胞蛋白质的结合。样品中也含有咪唑（一般来说，样品中咪唑浓度与结合缓冲液中的咪唑浓度相同）以进一步减少宿主细胞蛋白质的结合。在稍高浓度下，咪唑也可能会降低组氨酸标记的蛋白质的结合。

因此咪唑浓度必须优化，以确保高纯度（宿主细胞蛋白质的低结合）和高产率（组氨酸标记的目标蛋白质的强结合）之间的最佳平衡。达到最佳纯化结果的咪唑浓度因蛋白而异，通常Ni Sepharose 6 Fast Flow 使用的最佳咪唑浓度稍高于市场上类似的IMAC 介质（见数据文件11－0008－86）。并且使用高纯度的咪唑，它在280 nm 基本上无吸收。

除了咪唑洗脱的方法，组氨酸标记的蛋白质可以采用几种其他方法或一些方法的组合从介质中洗脱出来。例如，可以用在2.5-7.5 的范围内降低pH。当pH 值低于4 时，金属离子将会从介质中脱落。

注意：如果蛋白质对低pH 值敏感，我们建议用含有1 M Tris-HCl, pH 9.0（60-200 μl/ml 份）的管子来收集洗脱的组分，以维持pH 到中性。EGTA 和EDTA 会使金属离子从介质中脱落，从而引起蛋白质洗脱，目标蛋白质组分中就将含有Ni2＋离子。在这种情况下，Ni2＋离子可通过在HiTrapTM Desalting，PD-10 Desalting ，或HiPrepTM 26/10 Desalting 柱上脱盐去除（见表3）。

在全部正常条件下，从Ni Sepharose 6 Fast Flow中脱落的Ni2+是很低的，低于其他测试过的IMAC介质（见数据文件11－0008－86）。对于应用来说，至关重要的是纯化过程中Ni2+的脱落要很低，甚至可以再进行空白运行（见15页）来减少脱落。同样，在上含有还原剂的缓冲液/样品前（见15页），也应进行空白运行。无论选择何种条件， HisTrap FF crude柱都可以用注射器、恒流泵、或层析系统进行操作。

HisTrap FF crude柱是为直接从没有澄清过的细胞裂解液中纯化组氨酸标记的蛋白质而设计的。通过酶解及机械裂解进行样品的制备。样品上柱前无需离心及过滤。我们建议延长机械处理样品的时间，以确保裂解更加完全（将样品保持在冰中以防止过热）。

推荐的缓冲液
结合缓冲液*：20 mM 磷酸钠，500 mM NaCl，20-40 mM 咪唑，pH7.4（咪唑最佳浓度因蛋白而异；20-40 mM 适用于许多蛋白质）。
洗脱缓冲液*：20 mM 磷酸钠，500 mM NaCl，500 mM 咪唑，pH7.4（洗脱用咪唑的浓度因蛋白而异）。

* 缓冲液配方见附录A
如果重组的组氨酸标记的蛋白质作为包含体表达，在所有缓冲液及样品中应包括 6 M 的盐酸胍（Gua-HCl）或8 M 的脲，以促进蛋白的去折叠。变性蛋白在柱上重折叠可能是可以的，但因蛋白而异。克服与包含体相关的问题的忠告在故障排除中说明，见第7 节。

提醒：含脲的样品可直接用SDS－PAGE 分析，而含盐酸胍的样品，在SDS－PAGE 前必须用缓冲液交换成含有脲的缓冲液。

3 样品制备
对最佳生长和诱导的条件，请参考已确定的实验方案。
推荐的细胞裂解的四步实验方案
以下实验方案已经成功地用在我们的实验室。但其他已确定的步骤也可使用。
1. 稀释细胞泥：每克细胞泥加入5－10 ml 结合缓冲液。为了避免宿主细胞蛋白与暴露的组氨酸结合，关键是样品和结合缓冲液中要有低浓度的咪唑（见第5 节，纯化效率的优化）。
2. 酶裂解： 0.2 mg/ml 溶菌酶，20 μg/ml DNAase，1 mM MgCl2，1 mM PefablocTM SC 或PMSF（终浓度）。根据目标蛋白的敏感性而在室温或＋4℃下搅拌30 min。
3. 机械裂解*： 在冰中超声约10 min 或用 French Press 或其他匀浆器匀浆或冻/融，至少重复5 次。
* 机械裂解的时间一定要超过标准方法，以确保上样样品最佳的裂解(防止柱的堵塞及反压的问题)。不同的蛋白对细胞裂解有不同的敏感度，必须小心，避免样品起泡沫及过热。
4. 调整裂解液的pH: 不要使用强碱或强酸调节pH (有出现沉淀的危险)。在样品制备后将未澄清的裂解液直接上到柱上。

注意： 如果使用前匀浆或超声过的未澄清的细胞裂解液冻被住，沉淀及聚集的可能性加大。则就使用新超声的细胞裂解液可防止上柱时增加反压问题。

4 纯化操作
1. 用蒸馏水注满泵的管道或注射器。移去塞子，并将柱连接到层析系统的管道，用注射器（使用提供的接头）或实验室泵一滴接一滴的注入蒸馏水，以免将空气引入系统中。
2. 将在柱出口的速变弹簧夹移去。
3. 用 3-5 个柱床体积的蒸馏水洗去柱内的乙醇。
4. 用至少 5 个柱床体积的结合缓冲液平衡柱。建议对1 ml 和5ml 柱各自使用1 ml/min 和
5 ml/min 的流速。在有些情况下，我们建议在最后的平衡/上样前作空白运行。
5. 用注射器或泵将未澄清的裂解液上到柱上。建议在上样过程中，连续不断地搅拌样品以防止沉淀。典型的未澄清的裂解液的上样体积（高度取决于样品的特异性，样品的预处理，及上样的温度）：
HisTrap FF crude I ml： 最高 100 ml
HisTrap FF crude 5 ml： 最高 500 ml
注意：4℃时上样会增加样品的粘度。样品粘度增加的不利影响是柱的上样体积较低时，就达到了柱的最大反压。不要超过柱的结合容量。体积大可能加大反压，使注射器的使用更加困难。
6. 用结合缓冲液冲洗，直到吸收曲线稳定在基线（一般至少 10－15 个柱床体积）。
注意：样品和结合缓冲液中用咪唑可以改善纯化结果（见第5 节，纯化效率的优化）。
7. 用洗脱缓冲液分部或线性梯度洗脱。对于分部洗脱，5 个柱床体积的洗脱缓冲液通常已足够。对梯度不大，例如超过20 个柱床体积或更多的线性梯度，可将结合强度相似的蛋白质分离。
注意：在纯化过程中，未澄清的细胞裂解液可能会增加气泡的形成。如果产生此问题，在层析系统中接上流速限制器能防止此问题的出现。如果接上了流速限制器，重要的是将ÄKTAdesign 系统的压力极限改变为0.5 MPa (5 bar) (系统和流速限制器给定的压力分别为
0.3 MPa 和0.2 Mpa)。
注意：如果需要从蛋白中除去咪唑，根据样品的体积（见表3），选用HiTrap Desalting， PD-10Desalting，或 HiPrep 26/10 Desalting 柱去除。
注意：Ni2+Sepharose 6 Fast Flow与还原性试剂相兼容。但是，为优化效率时，建议在上含还原性试剂的缓冲液/样品前，进行不含还原性试剂的空白运行来去除任何结合较弱的Ni2+离子（见以下的说明）。当不使用时，不要将HisTrap FF crude 柱置于含还原性试剂的缓冲液中。
注意：在全部正常条件下，从Ni Sepharose 6 Fast Flow中脱落的Ni2+是低的。该脱落低于其他测试过的IMAC介质。对非常精细的应用，纯化过程中的脱落甚至可以在上样前进行空白运行进一步减少（见以下的说明）。完成空白运行使用不含还原剂的结合和洗脱缓冲液。
1. 用 5 个柱床体积的蒸馏水淋洗柱（去除20％的乙醇）。
2. 用 5 个柱床体积的洗脱液淋洗柱。
3. 用 10 个柱床体积的结合缓冲液平衡柱。

注意：如果柱已堵塞，可能要进行在位清洗，见第6 节。如果在位清洗不见成效，则换新柱。在下一次上样前优化样品的预处理。

5 纯化效率的优化
咪唑浓度
通常在结合和淋洗缓冲液中采用低浓度的咪唑来尽量减少宿主细胞蛋白质的结合。在样品中也要有咪唑（一般来说，样品中咪唑浓度与淋洗缓冲液中的咪唑浓度相同）来进一步减少宿主细胞蛋白质的结合。在稍高浓度下，咪唑也可能会降低组氨酸标记的蛋白质的结合。因此咪唑浓度必须优化，以确保高纯度（宿主细胞蛋白质的低结合）和高产率（和组氨酸标记的蛋白质的强结合）间的最佳平衡。此最佳咪唑浓度因不同的组氨酸标记的蛋白而异，通常Ni Sepharose 6 Fast Flow 稍高于市场上类似的IMAC 介质（见数据文件11－0008－86）。找到对特异的组氨酸标记的蛋白的最佳咪唑浓度是需要不断的努力和摸索，但对绝大多数蛋白来说，在结合和淋洗缓冲液中20－40 mM 的浓度是一个良好的起点。使用在280 μm 基本上无吸收的高纯度咪唑。

金属离子的选择
Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数（组氨酸）6 标记的重组蛋白质的首选金属离子。也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括，长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。

卸落及再荷电
注意： 如果纯化的是相同的蛋白，在每次纯化间柱没有必要卸落和再荷电。根据蛋白样品的特性、样品的预处理及样品的体积等情况，大约在2 到5 次纯化后才将柱卸落和再荷电。推荐的卸落缓冲液：20 mM 磷酸钠，500 mM NaCl，50 mM EDTA，pH7.4。用至少 5－10 个柱床体积的卸落缓冲液冲洗卸落柱。在柱再荷电之前，用至少5－10 个柱床体积的结合缓冲液和5－10 个柱床体积的蒸馏水冲洗柱。对水洗过的柱的再荷电，是通过将 0.5 ml 或0.25 ml 的0.1M NiSO4 的蒸馏水溶液分别上到HisTrap FF crude 1 ml 及5 ml 柱上。在用20％乙醇保存前，用5 倍柱床体积的蒸馏水和5倍柱床体积的结合缓冲液（调整到pH7.4）冲洗柱。其他金属的盐、氯化物、或硫酸盐也可使用（见本节的纯化效率的优化）。

6 按比例放大
从 HisTrap FF crude 1 ml 柱按比例放大到5 ml 柱，只要维持同样的线性流速，可得到高度一致的结果。

7 柱的清洗及保存
在位清洗
当发现反压增加时，柱就应当清洗。清洗前，按上述推荐的步骤卸落 Ni2＋离子。卸落 Ni2＋离子的柱可按下述方法清洗：用几个柱床体积的 1.5 M NaCl 洗，除去离子键合的蛋白，然后用大约10 个柱床体积的蒸馏水冲洗柱。

● 用1M NaOH，接触时间通常在1－2 h，去除沉淀的蛋白、疏水结合蛋白、及脂蛋白 (对去除内毒素需12 h 或更长)。然后用大约10 个柱床体积的结合缓冲液冲洗柱，再用5－10 个柱床体积的蒸馏水冲洗柱。
● 用 5－10 个柱床体积的30％ 异丙醇冲洗柱大约15－20 min，去除疏水结合蛋白，脂蛋白及类脂物。然后用大约10 个柱床体积的的蒸馏水冲洗柱。
另外，用2 个柱床体积的在碱或酸性溶液中的去污剂冲洗。例如，用在0.1 M 醋酸溶液中的0.1-0.5%的非离子去污剂，接触时间为1－2 h。在处理后，总是用至少5个柱床体积的70％的乙醇冲洗以除去残留的去污剂。然后用大约10 个柱床体积的蒸馏水冲洗柱。
注意：反相冲洗可改善在位清洗方法的效率。清洗后，保存在20％的乙醇中（用5 个柱床体积冲洗）或在用乙醇保存之前，用Ni2＋离子再荷电。按制造商的建议清洗层析系统。

8. 保存
在 20％的乙醇中，于4℃-30℃保存HisTrap FF crude 柱。

9 故障排除
下列提示可能有助于解决问题。如果您的 HisTrap FF crude 柱还有其他问题，请访问www.gehealthcare.com/hitrap 与我们的技术支持部门联系，或与您当地的GE Healthcare 代理处联系。

反压增加
● 提高机械破碎细胞的效率（例如，增加超声时间）。将样品保持在冰中，以避免起泡沫及过热而引起目标蛋白的变性。过度超声也会导致宿主细胞的蛋白与目标蛋白共同纯化。
● 超声前，加大细胞泥的稀释，或超声后稀释，以降低粘度。
● 如果由于宿主细胞的核酸浓度高而使裂解液很粘，继续超声直到粘度降低，和/或加入额外剂量的DNAase 及Mg2＋（见第3 节，样品制备）。另外，可用注射器针头抽取裂解液若干次。
● 未澄清的裂解液的冻/融可能会增加沉淀及聚集。上柱时，超声解冻的裂解液能防止反压增加的问题。
● 如果纯化操作已经在4℃进行，如有可能移到室温中进行（在室温下样品的粘度会降低）。
● 降低上样流速。

柱堵塞
● 如果在位清洗不见成效，更换柱。在下一次上样前，优化样品的预处理。蛋白难于溶解或在纯化期间沉淀
● 可以使用下述的添加剂：2% TritonX-100，2% Tween 20，2% NP-40 , 2% 胆酸，1% CHAPS，1.5 M NaCl， 50%甘油，20 mM β－巯基乙醇，1－3mM DTT 或DET(可以高达5 mM，但取决于样品和样品的体积)，5 mM TCEP，10 mM 还原型谷胱甘肽，8 M 脲，或6 M 盐酸胍。缓慢地混合30 min 以助标记蛋白质的溶解（包含体可能需要更长的时间混合）。注意Triton X-100 及NP-40（不是Tween）在280 nm有高吸收。另外，去污剂不能容易地经缓冲液置换去除。
● 蛋白可能不溶解（包含体）：用常用的失活剂，如4－6 M 盐酸胍、4-8 M 脲、或强去污剂，蛋白通常可能从包含体中溶解（和去折叠）。

制备含有20 mM 磷酸钠，8 M 脲，或6 M 盐酸胍，和适当浓度的咪唑，pH 7.4－7.6 的缓冲液。含有脲的缓冲液也应含有500 mM NaCl。用这些缓冲液配置样品，以及结合缓冲液，并作为洗脱缓冲液。对样品制备和结合缓冲液，在优化试验中，用10－20 mM 的咪唑或所选择的浓度（包括脲和盐酸胍）。为尽量减少样品的稀释，可加入固体的盐酸胍或脲。

纯化的组分中无组氨酸标记的蛋白质
● 洗脱条件太温和（组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上）：用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH 来找出最佳的洗脱条件。
● 蛋白已沉淀在柱上：减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl 的浓度，或在变性条件（去折叠）下洗脱（用4－8 M脲，或4－6 M 盐酸胍）。
● 非特异性疏水或其他相互反应：加非离子去污剂到洗脱缓冲液（如，2% TritonX-100）或增加NaCl 的浓度。
● 流穿液中发现蛋白: 在样品和/或结合缓冲液中的咪唑浓度太高，降低咪唑浓度。
● 流穿液中发现蛋白: 组氨酸标记可能没有充分暴露；如对包含体一样，在脲或盐酸胍存在下进行去折叠蛋白的纯化。为尽量减少样品的稀释，可加入固体的盐酸胍或脲。
●流穿液中发现蛋白: 缓冲液/样品的组成份欠佳；检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在样品中鳌合剂或强还原剂的浓度以及咪唑的浓度不是太高。

洗脱的蛋白不纯 (在SDS-聚丙酰胺凝胶电泳上呈现多条带)：
● 标记的蛋白被蛋白酶部分降解：加入蛋白酶抑制剂（谨慎使用EDTA，见表2）。
● 杂质对鎳离子有高亲和力：用分步或咪唑线性梯度洗脱，以找出最佳咪唑浓度用于结合及冲洗；在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑。洗脱前用含有最高可能的咪唑浓度（选择的咪唑浓度必须不引起组氨酸标记的蛋白的洗脱）的结合缓冲液，彻底地冲洗柱。咪唑的梯度不大（20 个或更多的柱床体积），可能分离出有相似结合强度的蛋白。如果优化的条件不能除去杂质，可能需要用离子交换层析（HiTrapQ HP 或HiTrap SP HP）和/或凝胶过滤（SuperdexTM Peptide, Superdex 75,或 Superdex200）进一步纯化。
● 杂质与标记的蛋白结合在一起：在超声细胞前，加入去污剂和/或还原剂。提高洗脱液的去污剂的水平（例如，高达2% 的Triton X-100 或2%的Tween 2 0），或加甘油（低于50％）到洗脱缓冲液中，以破坏非特异的相互反应。

上样及冲洗期间，组氨酸标记蛋白被洗脱
● 缓冲液/样品的组成份欠佳：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在样品中的鳌合剂或强还原剂浓度以及咪唑的浓度不是太高。
● 组氨酸标记被部分遮盖：在变性条件下（用4－8 M 脲，或4－6 M 盐酸胍）进行纯化。
● 超过柱的容量：如果使用的是HisTrap FF 1 ml 柱，改换成较大的HisTrap FF 5 ml柱。

不希望的气泡出现：
● 纯化过程中未澄清的裂解液可能引起气泡的增加。在层析系统中接上流速限制器可以防止这一现象的出现。如果装上了流速限制器，重要的是在ÄKTAdesign 系统上将压力极限更改为0.5 MPa (5 bar) (柱和流速限制器给定的压力各自为0.3 MPa 和0.2 Mpa)。

完整版请点击下载：HisTrap_FF_crude中文

产品说明书请点击下载：HisTrap FF crude, 1 ml and 5 ml

HisTrap™ FF crude is a ready to use column, prepacked with precharged Ni Sepharose™ 6 Fast Flow. This prepacked column is intended for purification of histidine-tagged recombinant proteins by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). After thorough cell disruption, it is possible to load the unclarified lysate on the column without precentrifugation and filtration of the sample. Extending the duration of the mechanical treatment of the sample to ensure a more complete lysis is recommended.

Ni Sepharose 6 Fast Flow has low nickel ion (Ni2+) leakage and is compatible with a wide range of additives used in protein purification. The special design of the column in combination with the medium, provide fast, simple, and convenient purifications. Short purification time generally minimizes deleterious effects, such as degradation and oxidation of sensitive target proteins, and is therefore of great importance. HisTrap FF crude columns can be operated with a syringe, peristaltic pump, or liquid chromatography system such as ÄKTAdesign™ chromatography systems.