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GenomiPhi扩增利用FTA技术从血样中获得的人基因组DNA
2013年09月06日 产品应用 评论数 1 ⁄ 被围观 2,776+


WhatmanTM FTA技术为DNA的储存和制备提供了一种前所未有的方法,利用FTA技术获得的DNA样品可以直接用于扩增。

WhatmanTM FTA产品是野外核酸采集、运输、储存和纯化最简单、有效的工具,并且适用于各种样品来源。无论是动物、植物还是微生物细胞,只需直接将样品滴加到FTA卡上,卡片上的化学物质就会裂解细胞、失活蛋白并捕获核酸(图1)。在整个处理过程中,传染源也会被失活。样品干燥后,卡片上的核酸被保护免受酶、微生物、氧化剂和自由基的损害。样品能在室温下保存数年(目前为止FTA卡上的血样已被保存17年之久)。

在需要分析或使用储存在FTA卡上的DNA时,只需用打孔器从卡上取一个小圆片下来,用FTA纯化试剂洗去FTA上的杂质,结合在小圆片上的纯化的DNA就可以直接用于PCR扩增、限制性酶切反应或其他研究方法。然而,有一些研究需要用到大量的DNA,远远超过了小圆片上结合的DNA甚至是整个样品中含有的DNA;还有
一些应用需要研究多个序列片段,即使多重PCR也无法满足需求。过去,为了满足这些应用需求,需要从更大的样品中提取DNA。全基因组扩增(WGA)技术为从小样品中获得无限量DNA提供了解决方案。

用于全基因组扩增的GenomiPhi DNA扩增试剂盒利用Phi29DNA聚合酶和多链置换机制, 能够从 ng 级线性 DNA 模板中扩增得到 mg 级高分子量拷贝。只需保存在 FTA 卡上少量的 DNA就能扩增得到足够多个 SNP 分析和其他下游应用的 DNA。(详细参见www.gelifesciences.com/genomiphi)这个应用资
料提供了一个利用 GenomiPhi 扩增在 FTA 卡上储存、纯化的人基因组 DNA 的实例。

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图 1. 滴加了血样的 FTA 卡

方法

依照如下的 FTA 标准流程操作,将新鲜的指尖血滴加到 FTA 卡上,自然干燥。样品在室温下避光储存 5 周,在加样区用 Harris 取样器取 1.2或 2.0 mm 直径小圆片,在未加样的区域取空白圆片作为对照。所有圆片在 200 μl FTA 纯化试剂中洗 3 次,每次 5 分钟,再用 200 μl TE-1 (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH8.0)洗 2 次,每次 5 分钟。

标准GenomiPhi扩增流程:将清洗过的小圆片分别加到9 μl GenomiPhi 样品缓冲液中。扩增前,在对照组圆片中加入20ng纯化的人基因组DNA,样品在95oC孵育3分钟后置于4oC3分钟。每管中加入含有1 μl 聚合酶的10 μl GenomiPhi反应缓冲液。简单混匀每管内容物,30oC孵育过夜(约16小时),然后置于65oC10分钟,最后储存于4oC。

从每管中取 4 μl样于含有EB的0.6%琼脂糖凝胶上电泳。

推荐操作流程
1) 样品常规保存于 FTA 卡上,避光储存在干燥室温条件下。
2) 用打孔器取小圆片 (血样 1.2 mm) 放入管中。
3) 用 200 μl FTA 试剂洗小圆片 3 次,每次 5 分钟。
4) 用 200 μl TE-1 中吹洗圆片 2 次,每次 5 分钟。小圆片被完全脱色。
5) 将小圆片在室温下干燥 1 小时 (可选)。
6) 每管中加入 10 μl (如果圆片是湿的,加 9 μlGenomiPhi 样品缓冲液。
7) 95oC 孵育 3 分钟后转置于冰上。
8) 如需要,快速离心以收集冷凝物。
9) 加 10 μl GenomiPhi 反应混合物(含有 1 μlPhi29 聚合酶)混匀。
10) 30oC 孵育过夜(约 16 小时)。
11) 65oC 孵育 10 分钟,储存于 4oC。

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图 2. 在FTA卡上获得的人基因组DNA扩增后凝胶电泳图

Lane M: 1 kb DNA ladder
Lane 1: 阳性对照 DNA (非 FTA 法)
Lane 2: 阴性对照 (无 DNA 或 FTA)
Lanes 3-5: 扩增 1.2mm 样品小圆片
Lanes 6-8: 扩增 2.0mm 样品小圆片
Lane 9: 扩增 1.2mm 对照 (未加血样) 圆片加阳性对照 DNA
Lane 10: 扩增 2.0mm 对照 (未加血样) 圆片加阳性对照 DNA

结果

图片显示,在此试验中,从 FTA 卡上截取的1.2mm 小圆片上捕获的人基因组 DNA,经GenomiPhi 扩增有明显条带(3~5 泳道),而2.0mm 圆片上的 DNA 扩增失败(6~8 泳道)。加入了DNA的1.2mm和2.0mm的FTA对照圆片(清洗过)同样被扩增(9 和 10 泳道)。

在另外 2 组试验中,从保存有人 DNA(来自于血样)的 FTA 卡上取 1.2mm 圆片扩增后有明显条带,而 2.0mm 圆片扩增后没有条带(数据未展示)。但是 GenomiPhi 成功扩增了结合于较大圆片上的口腔细胞 DNA,并且清洗过的圆片并没有抑制对照组 DNA 的扩增。这表明,结合在较大圆片上的 DNA 模板可能过量,从而抑制扩增。

结论

保存于 FTA 卡上的人血样 DNA 可以用GenomiPhi 进行全基因组扩增,这种方法集合了FTA 在采集小样本、室温下安全储存和节约成本等方面的优点,以及全基因组扩增在需要大量DNA 的应用中的优势。



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