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双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照蛋白的pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照蛋白的分子量大小分离），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
实验方法
材料准备
- 胶条
- 两性电解质
样品处理
一般性原则
样品制备是双向电泳中最为关键的一步，这一步处理的好坏将直接影响 2-DE 结果。目前并没有一个通用的制备方法，尽管处理方法是多种多样，但都遵循几个基本的原则：
- 尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；
- 减少对蛋白质的人为修饰；
- 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。
根据这一原则，样品制备需要以下几种主要的试剂：
- 离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea） ；
- 表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，早期常使用 NP-40、TritonX-100 等非离子去垢剂，近几年较多的改用如 CHAPS与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；
- 还原剂（reducing agents） ，最常用的是二硫苏糖醇（DTT） ，也有用二硫赤藓糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。
- 蛋白酶抑制剂（如 EDTA、PMSF or Protease inhibitorcocktails）
- 核酸酶。
- 当然，也可以选择性的加入Tris-base。
样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 IPG 胶条；这样都会造成 2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。
核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。 因此，处理方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。
样品制备程序
培养细胞样品处理方法
培养动物组织细胞由于没有细胞壁，因此可以将细胞收集下来，直接加入裂解缓冲液（Lysis buffer）抽提总蛋白。裂解缓冲液有多种配方，主要有如下成份：
- (A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.
其他常用的裂解缓冲液如下：
- (B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3-10, 1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;
- (C) 加入 0.3-1% SDS在95°C 煮样品 5mins，冷却后加入至少5倍体积的（A）或（B）裂解液。
总蛋白抽提程序：
- 培养细胞的收集；
- 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞 3 次（室温，1000g，各 2min）；
- 将细胞分装到 1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的 PBS；
- 加入裂解缓冲液（1.5×106 个细胞大约加入 100µL裂解液） ，在室温振荡 1h，使其充分溶解；
- 4°C，40,000g，离心 1h；
- 吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78°C备用。
组织样品处理方法
对大多数从动物或植物组织里提取总蛋白质而言，同样没有一种通用的程序。但遵循的原则基本相同。下面列出一种对植物树叶总蛋白的方法。
三氯醋酸－丙酮沉淀法提取植物树叶总蛋白程序：
- 在液氮中研碎叶片；
- 悬浮于含 10％三氯醋酸（TCA）和 0.07%β-巯基乙醇(可用DTT替代)的丙酮溶液在－20 °C的冰浴；
- 让蛋白质沉淀过夜然后离心（4°C，40,000g, 1h） ，弃上清；
- 重悬沉淀浮于含 0.07%β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液里；
- 离心（4°C，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；
- 用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，离心（4°C，40,000g, 1h）。
- Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78°C备用。
超速离心法：
- 取材；
- 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入 0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆 30 s；
- 组织悬液 15°C，10 000×g离心 10 min；
- 上清液 4°C，150 000×g超速离心 45 min；
- 小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6°C 40,000g再次离心 50 min；
- 取离心上清。Bradford法定量，分装后置–75°C保存。
文献报道较多的裂解液配方
注：CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。其中 C-F是分步法提取的4种裂解液配方, C适于提取水溶性蛋白，D是经典配方，E适于提取膜蛋白配方，F适于提取难溶的沉淀蛋白。
Lysis buffer A
9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors
| 成分 | 终浓度 | 量 |
|---|---|---|
| 尿素（Urea） | 9 M | 10.8 g |
| CHAPS | 4% (w/v) | 0.8 g |
| 加超纯水至终体积20 ml | ||
新鲜配制，或-20°C冻存。使用时加入cocktail蛋白酶抑制剂和DTT储存液至DTT终浓度为1%（例如，200 μl裂解液中加入13 μl 15.5×的DTT储存液）。
Lysis buffer B
7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors.
Lysis buffer C
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O
Lysis buffer D
8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml
| 成分 | 终浓度 | 量 |
|---|---|---|
| 尿素（Urea） | 8 M | 9.6 g |
| CHAPS | 4% (w/v) | 0.8 g |
| Tris-base | ||
| 加超纯水至终体积20 ml | ||
新鲜配制，或-20°C冻存。使用时加入cocktail蛋白酶抑制剂和DTT储存液至DTT终浓度为1%（例如，200 μl裂解液中加入13 μl 15.5×的DTT储存液）。
Lysis buffer E
5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors
| 成分 | 终浓度 | 量 |
|---|---|---|
| 尿素（Urea） | 5 M | 3.0 g |
| thiourea | 2 M | 1.52 g |
| SB 3-10 | 2% | 0.2 g |
| CHAPS | 2% (w/v) | 0.2 g |
| 加超纯水至终体积10 ml | ||
新鲜配制，或-20°C冻存。使用时加入cocktail蛋白酶抑制剂和DTT储存液至DTT终浓度为1%（例如，200 μl裂解液中加入13 μl 15.5×的DTT储存液）。
Lysis buffer F
100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)
等电聚焦
双向电泳的第一向 IEF 电泳采用 IPGphor，实验将变得很简单。IPGphor 包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。可采用普通型胶条槽一步 完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor 一次可进行 12 个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最新推出的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的 IPG 胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。
IPG 胶条的水化和电泳
配制水化液
| 成分 | 终浓度 |
|---|---|
| 尿素 | 8 M |
| CHAPS | 2% |
| DTT | 15 mM |
| IPG buffer | 0.5% |
- 水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20 度保存，但不可反复冻融)。尿素溶液加热温度不能超过 37°C，否则蛋白会发生氨甲酰化。
加样品水化
- 用样品溶解缓冲液(9M 尿素，4%CHAPS，2%IPG 缓冲液，40mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品 。蛋白质上样浓度不要超过 10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。
- 吸取适量含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。
| 胶条长度(cm) | 每条需水化液体积注(μl) |
|---|---|
| 7 | 125 |
| 11 | 200 |
| 13 | 250 |
| 18 | 350 |
| 24 | 450 |
注:如果水化时加入样品，此体积是加入样品后的终体积
- 从酸性端（尖端）一侧剥去 IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将 IPG胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下 IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。
- IPG 胶条上覆盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油，盖上盖子。
- 将标准型胶条槽的尖端背面电极与 IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。
- 设置 IPGphor 仪器运行参数：IPG 胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见下表。
| 温度 | 20°C |
| 最大电流 | 0.05 mA per IPG strip注1 |
| 样品体积 | 350 μl (180 mm 长 IPG strip) |
| 电压 | 时间 |
|---|---|
| 30 V | 10-12 hours(水化)注2 |
| 200 V | 1 hour |
| 500 V | 1 hour |
| 500 -> 8000 V | 30 min |
| 8000 V | 3 hours (IPG 4-7) ; 2 hours (IPG 4-9, 3-10L, 3-10NL) |
注1：不推荐每条 IPG 胶条的电流超过 50µA，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG 胶条甚至会烧胶。
注2：低电压时水化，有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。
- IPG 胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。
- 暂时不进行第二向的 IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C 保存几个月。
不加样品水化
标准型胶条槽
- 用适量的水化液进行胶条水化，方法同上述步骤，水化过夜。
- 于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧可加入 7.5μl样品(每个加样孔分别有两侧可加样)，采用此种方法上样，每个胶条槽最多可加入 30μl 样品。
- 设置 IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度，电泳参数见上述步骤。
- 进行等电聚焦电泳。
- 暂时不进行第二向的 IPG胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C保存几个月。
通用型杯上样胶条槽
- 采用 Immobiline DryStrip 水化盘或标准型胶条槽进行 IPG 胶条的水化，加入适量的 水化液进行胶条水化，方法参见上述步骤，水化过夜。
- 将通用型杯上样胶条槽的尖端与 IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。
- 将已水化的 IPG 胶条转移到通用型杯上样胶条槽。胶面朝上，先将 IPG胶条尖端(阳性端)朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，胶条必需横跨胶条槽的与 IPGphor 仪器的两个电极板接触的区域。对于 7cm 和 11cmIPG胶条，需将 IPG 胶条的平端距离胶条槽平端大约 1.5cm 处放置，并确保胶条位于胶条槽的中央(通用型杯上样胶条槽内四对凸起可用于指导胶条放置的位置)。
- 在 IPG 胶条表面上盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油(3-5ml)，充满整个胶条槽 。
- 取两个 IEF 电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。
- 分别将两个 IEF 电极片放在 IPG 胶条胶的两端， 分别将电极压在两个电极片的外缘。
- 样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的 IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置。
- 在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。
- 上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样 100μl。
- 盖上胶条槽的盖子，再盖 IPGphor 仪器的盖子。
- 设置 IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见上述步骤。
胶条的平衡
IPG 胶条平衡两次，每次 15 分钟。平衡缓冲液包括 6 M 尿素和 30% 甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在平衡液中加入 DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的 DTT 烷基化(银染过程中，DTT 会导致点拖尾"point streaking") 。将 IPG 胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向 SDS 胶中。
|
如果缩短平衡时间，会影响一部分蛋白从 IPG胶条转移到SDS胶的效率。这种情况下建议在蛋白从 IPG胶条转移到SDS胶后，将 IPG胶条染色，以检查是否所有蛋白都已离开 IPG胶条 |
材料准备
| 仪器 | |
| 平衡管 | |
| Parafilm | |
| 振荡仪 | |
| 试剂 | |
| 4x 分离胶缓冲液 | 1.5M Tris-HCl, pH8.8 和 0.4%（w/v）SDS：45.5g Tris 和 1g SDS 溶于 200ml 去离子水中，用 6N HCl 调节 pH 到 8.8，最后用去 离子水将体积补足到 250ml，加入 25mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于 4°C 储存两周。 |
| 平衡缓冲液 | 0.05 M Tris-HCl , pH 8.8，6 M 尿素, 30% (w/v) 甘油和 2% (w/v) SDS：180 g 尿素, 150 g 甘油, 10 g SDS 和 16.7 ml 分离胶缓冲液溶于去离子水中， 最终将 体积补足到 500ml。 此种缓冲液可于室温下保存两周。 |
| 溴酚蓝溶液 | 0.25% (w/v) 溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中25 mg 溴酚蓝溶于 10 ml 分离胶缓冲液中， 4°C 储存。 |
实验步骤
- 使用前每 10ml 平衡缓冲液中加入 100mg DTT (相当于平衡缓冲液 I)，根据下表加入适量平衡缓冲液 I 和溴酚蓝溶液。取出 IPG 胶条分别放入玻璃管中(支持膜贴着管壁，每个玻璃管中放入一条 IPG 胶条)，用Parafilm 封口，在振荡仪上振荡 15 分钟，倒掉平衡缓冲液 I。
- 每 10ml 平衡缓冲液加入 400mg 碘乙酰胺 (相当于平衡缓冲液 II)。根据下表加入适量平衡缓冲液 II 和溴酚蓝溶液。用 Parafilm 封口，在振荡仪上振荡 15 分钟，倒掉平衡缓冲液 II。
| 胶条长度(cm) | 建议平衡液体积(ml)/条 | 溴酚蓝溶液(μl) |
|---|---|---|
| 7 | 2.5-5 | 12.5-25 |
| 11 | 5-10 | 25-50 |
| 13 | 5-10 | 25-50 |
| 18 | 10 | 50 |
| 24 | 15 | 70 |
- 用去离子水润洗 IPG 胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
- IPG 胶条的转移：将 IPG 胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将 IPG 胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在 IPG 胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。
- 可选操作：加入分子量标准蛋白，分子量标准蛋白溶液与等体积的 1%琼脂糖溶液混合后，加入到 IEF上样纸片上能得到很好的效果。终浓度为0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。 其他可选的方法是，将标准蛋白以 15-20 μl 的体积加入到 IEF 上样滤纸片。如要减少加样量将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上，然后用镊子将上样滤纸片放置在 IPG 胶条末端一侧，与板胶的凝胶表面接触。
- 最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量的密封液（约 1-1.5ml) 使 IPG胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。
SDS-PAGE
目前由于更多的使用垂直的系统来进行第二向 SDS-PAGE， 故这里不再介绍水平的 MultiphorII 系统。
材料准备
| 溶液 | |
| 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液 | （30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积补足到 1000ml。过滤后可于 4°C 储存两周。 |
| 分离胶缓冲液 | （1.5M Tris-HCl, pH8.6 和 0.4%（w/v）SDS）90.85gTris 和 2gSDS 溶于 400ml 去离子水中，用 6N HCl 调节 pH 到 8.6，最后用去离子水将体积补足到 500ml，加入 50mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于 4°C 储存两周。 |
| 10%（w/v）过硫酸铵溶液 | 1g 过硫酸铵溶于 10ml 去离子水中。此溶液需使用前新鲜配制。 |
| 覆盖液 | （缓冲液饱和的异丁醇）：混合 20ml 上述分离胶缓冲液和 30ml 异丁醇，等几分钟后去掉异丁醇层。 |
| 取代液 | （50%(v/v)甘油和 0.01%溴酚蓝水溶液）：混合 250ml 甘油（100%）和 250ml 去离子水，再加入 50mg 溴酚蓝，搅拌几分钟。 |
| 低熔点琼脂糖溶液 | 含有 0.5%(w/v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。 |
灌胶
根据第一向 IEF 电泳时 IPG 胶条的大小选择第二向合适的垂直电泳槽。最新推出的 Ettan DALT II 是为大规模、高通量、高重复性双向电泳第二向SDS-PAGE 专门设计的。 同时进行 12 块 26 x 20cm 板胶电泳，适于长至24cmIPG 胶条。其灌胶模具每次最多可 灌制 14 块胶。通常不需要浓缩胶。
- 按仪器说明书装好灌胶模具，倒入凝胶溶液（在 Hofer DALT 和 Ettan DALT II 的灌胶模具中，拔掉灌胶的胶管后，取代液会把管道中剩余的凝胶溶液压入模具中） 。在每块胶的上面加入覆盖液以得到平的凝胶上样平面。
- 灌胶后立即在每块凝胶上铺上一层用水饱和的正丁醇或异丁醇，以减少凝胶暴露于氧气，形成平展的凝胶面。
- 同时灌制多块凝胶时，室温下至少聚合 3 小时。聚合后倒掉覆盖在凝胶上的正丁醇溶液，并用凝胶储存液冲洗凝胶表面。
- 暂时不需要的凝胶可用塑料薄膜包好于 4°C 保存 1-2 天。将整个凝胶模具完全浸没在凝胶储存液中可 4°C 条件下保存 1-2 周。
| 胶浓度 | 分离范围(KD) |
|---|---|
| 5% | 36-200 |
| 7.5% | 24-200 |
| 10% | 14-200 |
| 12.5% | 14-100 |
| 15% | 14-60 |
| 10%T，2.6%C | 12.5%T，2.6%C | 15%T，2.6%C | |
|---|---|---|---|
| 单体贮存液 | 33.3 ml | 41.7 ml | 50 ml |
| 4x 分离胶缓冲液 | 25 ml | 25 ml | 25 ml |
| 10%SDS | 1 ml | 1 ml | 1 ml |
| 去离子水 | 40.2 ml | 31.8 ml | 23.5 ml |
| TEMED注1 | 33 μl | 33 μl | 33 μl |
| 过硫酸铵注1（10%） | 500 μl | 500 μl | 500 μl |
| 最终体积 | 100ml | 100ml | 100ml |
注1：TEMED和过硫酸铵在灌胶前加。
最终得到的胶的组成：分离胶：10%T、12.5%T 或 15%T 的均匀胶，2.6%C，0.1%SDS, 375mM Tris-HCl PH8.8
| 垂直电泳仪器类型 | 配制凝胶溶液体积(ml) |
|---|---|
| MiniVE or SE260(10X10.5cm 玻璃板) | |
| 1mm 厚的胶 | 10 |
| 1.5mm 厚的胶 | 15 |
| SE600(18X16cm 玻璃板) | |
| 1mm 厚的胶 | 30 |
| 1.5mm 厚的胶 | 45 |
| Ettan DALT II(26x20cm 胶) | |
| 14 块 1mm 厚的胶 | 950 |
跑胶
- 电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度为 15°C。
- 将平衡好的 IPG 胶条浸入电极缓冲液中几秒钟。
- 将 IPG 胶条小心的放置于 SDS 胶面上，并轻压使 IPG 胶条与 SDS 胶面充分结合，上面覆盖 2ml 热的琼脂糖溶液(75°C)，使琼脂糖在 5 分钟内凝固。其余的 IPG 胶条重复上述操作。
- 将胶盒插入电泳槽中，开始电泳。采用垂直的 SDS 胶电泳，不必象水平电泳一样，电泳过程中去除 IPG 胶条。
- 当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。
- 跑好的胶转移到染色盒里固定，准备染色
| SE600 系统电泳参数（恒流， 15 °C） | ||
| Phase | Current | Duration |
| 1 | 10mA per gel | 15 min |
| 2 | 20mA per gel | Approximately 5 h |
| Ettan Dalt II 系统电泳参数（恒定功率, 20°C） | ||
| Phase | Current | Duration |
| 1 | 5w per gel | 45 min |
| 2 | 20w per gel | Approximately 6 h |
染色
2-DE 胶蛋白质点的检测方法大致有：
- 考马斯亮蓝染色法；
- 银染法；
- 负染法；
- 荧光染色法；
- 放射性同位素标记法等。
这几种检测方法的灵敏度各不相同。目前最常用的是银染法和考染法。由于银染的灵敏度是考染的 50 倍，故一般用银染法进行分析处理，再用考染法来进行样品微量制备。
考马斯亮蓝染色
| 步骤 | 溶液 | 时间 | |
|---|---|---|---|
| 1 | 固定 | 20 % TCA | 1h |
| 2 | 染色 | 0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid | 2h |
| 3 | 脱色 | 40% EtOH&10% acetic acid | 2x 30 min |
| 4 | 强化 | 1% acetic acid | overnight |
| 5 | 清洗 | deionized H2O | 30 min |
局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot）
Neuhoff 胶体考染法
| 步骤 | 方法 | |
|---|---|---|
| 1 | 固定 | 12％（w/v）三氯醋酸（TCA），2h |
| 2 | 染色 | 200ml染色液混合 50ml甲醇，16-24h 染色液：在 490ml含 2％（w/v）的H3PO4中加 50g (NH4)2SO4直至完全溶解，再加 0.5g CBB G-250（已溶于 10mlH2O中），搅拌混合。无需过滤，使用前摇匀。 |
| 3 | 漂洗 | 1）0.1 mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟； 2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过 1min |
| 4 | 稳定 | 在 20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。 |
优点：背景低，灵敏度高，可达到 200ng protein/spot.
热考马斯亮兰染色及二次染色法
- 染色（0.025%(w/v) 考马斯亮兰R350） ：将 1 片 Phast Gel Blue 药片溶入 1.6L 10%醋酸， 将染色液加热到 90 °C倒入凝胶染色盘， 振荡 10min；
- 脱色：10%醋酸室温振荡脱色 2h，期间需多次更换脱色液，脱色液可通过铺有活性炭的滤纸层过滤回收；
脱色液和染色液可重复使用。 脱色后的凝胶可进行扫描分析，选中的点可用 Spot Picker 自动切胶仪挖出，再进行后续的硝酸银染色可得到更多的蛋白点。用考马斯亮兰预染过的胶再进行银染灵敏度比单独银染更高，且热染过程迅速。
二次染色
待考马斯亮兰染色后的背景完全脱除后，可用以下的银染法进行二次染色。因为蛋白点已经经过固定，可直接从敏化步骤开始染色。
硝酸银染色
银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有 100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性 pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于 1 ng/蛋白质点，故广泛的用在 2D 凝胶分析上。待找到自己感兴趣的蛋白质点后，再通过考染富集该目的点，然后做进一步的肽段指纹图谱分析（PMF）或序列测定。随着质谱技术的不断完善和发展，对银染后的 f mol 级的蛋白质点直接测定已非难事。这里介绍一种可兼容质谱分析的银染方法，实验程序如下：
| Step | Solution (250ml per gel) | Gel Type | |
|---|---|---|---|
| 1mm unbacked | 1mm on film or glass support or 1.5 unbacked | ||
| 固定 | 25ml acetic acid, 100ml methanol 125ml milli-Q water | 2x15 min | 2x60 min |
| 敏化 | 75ml methanol, 0.5g Na2S2O3, 17g NaAc, milli-Q water to 250ml | 30 min | 60 min |
| 漂洗 | 250ml milli-Q water | 3x5 min | 5x8 min |
| 银染 | 0.625g AgNO3, milli-Q water to 250ml | 20 min | 60 min |
| 显色 | 6.25g Na2CO3, 100μl formaldehyde, milli-Q water to 250ml | 4 min | 6 min |
| 终止 | 3.65g EDTA, milli-Q water to 250 ml | 10 min | 40 min |
| 漂洗 | 250ml milli-Q water | 3x5 min | 2x30 min |
银染注意事项：
- 很多银染程序都使用了戊二醛（glutardialdehyde） ，它能提高银染的灵敏度和染色结果的重复性，但是因为戊二醛会修饰蛋白质，从而会影响对蛋白质点的质谱鉴定和分析；
- 保证所有的染色器皿绝对的干净，可使用玻璃或塑料做染色器皿；
- 水的纯度对染色结果好坏影响是很大的，至少要用双蒸水（导电率<2μS） ，有条件的可使用 Millipore water；
- 染色过程中避免手去接触凝胶，必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套；
- 所用的化学试剂一定是要分析纯（ AR ）。
切胶
质谱分析
常见问题及其解答
- 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？
- 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
- 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？
- 这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。
- 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？
- 电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
- 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？
- 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。
- 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？
- 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
- 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？
- 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
- 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？
- 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
- 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？
- 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
- 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？
- 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。
- 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？
- 可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。
- 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？
- 横的脱尾可能是： 1 ）一向等电聚焦不完全； 2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。
- 什么成分会影响 2D 胶的效果？
- 核酸，盐，去垢剂等等。
- 2D 胶的上样量应该在什么范围？
- 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。
- 我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？
- 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（ 不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。
-
总的策略
- 化学试剂纯度要高，至少是分析级，目前国产试剂达不到纯度要求
- 使用去离子水(电导<2uS)
- 尿素和丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺需新鲜配制
- Deionize urea prior to use
- 包含尿素的溶液加热温度不超过 37°C,否则会发生蛋白质氨甲酰化
- 过滤所有的溶液，使用干净无灰尘的容器
样品制备
- 样品提取缓冲液(裂解缓冲液)必须新鲜配制。或者分装成 1ml，于-78°C冷冻保存， 裂解缓冲液一旦溶解不能再冷冻
- 如有必要，在细胞裂解时加入蛋白酶抑制剂。注意：几种蛋白酶抑制剂在 DTT 或β-巯基乙醇存在时失效
- 40000g 离心 1 小时以去除蛋白提取液中的不溶物
灌胶
- 过硫酸铵溶液需新鲜配制。40%过硫酸铵溶液储存于冰箱中只能使用 2-3天，低浓度过硫酸铵溶液只能当天使用
- TEMED 需在氮气下储存，每 6 个月换一次
- 带 U 型框的玻璃板需用疏水硅烷处理，避免胶聚合后与玻璃板粘连
- 水平 SDS 浓缩胶中加入甘油(37.5%)的目的是为了减少电内渗
- 如果 SDS 胶结合于 GelBond PAG 膜上， GelBond PAG 膜需用去离子水洗 6 次，每次 10 分钟， 以避免银染过程中产生点托尾
胶聚合不完全的可能原因 解决办法 TEMED 或过硫酸铵时间太长 替换 TEMED 和过硫酸铵 SDS 胶：Tris 缓冲液的 pH 值 用 HCl 调 Tris 缓冲液的 pH6.8 或 8.8 胶从塑料支持膜上脱落的可能原因 解决办法 胶聚合于 GelBond PAG 膜的疏水面 胶必须聚合于 GelBond PAG 膜的亲水面 塑料支持膜选择错误(如：用于琼脂糖胶) 选择专门用于聚丙烯酰胺胶的支持膜 GelBond PAG 膜过期 不要使用超过一年的 GelBond PAG 膜 胶结合于玻璃板上的原因 解决办法 玻璃板没有疏水处理 玻璃板用疏水硅烷处理 IPG 胶条的水化
- IPG 胶条需水化到 0.5mm 厚
- IPG 胶条的的水化时间取决于水化缓冲液的组成。如果尿素(>8M)和去污剂(>1%)浓度过高，至少需水化 6 小时，最好过夜*采用 Multiphor II 做第一向电泳时，水化后的 IPG 胶条需用去离子水清洗，否则 IPG 胶条表面会有尿素结晶，干扰 IEF。(使用 IPGphor 时，IPG胶条水化后不必清洗)
- IPG 胶条水化时，其胶面与水化盘或胶条槽之间避免产生气泡。采用胶条槽水化时，胶条上需覆盖硅油以防水化液挥发
第一相 IEF
采用样品杯上样
- 样品体积不能少于 20μl
- 样品在阴极或阳极附近上样，未知样品需检查在何处上样，结果更好
- 样品浓度不能过高(最大 10mg/ml)，以避免在上样位置生成蛋白沉淀。如果怀疑，最好用裂解缓冲液稀释，增大上样体积
- 样品溶液中不能含高浓度的盐。脱盐或用裂解缓冲液稀释，低电压使样品慢慢进入胶中
水化时加入样品
- 样品溶液体积需根据 IPG 胶条大小调整(18cm 长 IPG 胶条约需 400μl 样品溶液)，以保证水化后没有多余的样品留在水化盘中。最好检查高分子量蛋白、碱性蛋白或膜蛋白是否进入 IPG 胶中
等电聚焦
- 使用 IPG 胶条时，不要进行预聚焦，否则会因为胶的电导非常低导致样品很难进入胶条
- 为使样品进入胶的效率增加，采用 30V 低电压水化；继续以低电压梯度(200V，500V，1000V 各 1 小时)进行电泳，最后达到 8000V 的进行电泳聚焦时间跟 IPG 胶条的长度、pH 范围有关。短的 IPG 胶条或宽 pH 梯度范围 IPG 胶条，聚焦时间短
- IEF 结束后，如果 IPG 胶条暂时不进行第二向电泳，可于-78°C 冷冻保存
- 上样附近有水析出是因为样品盐浓度过高，可脱盐或稀释样品，低电压上样，延长样品进入胶的时间
IPG 胶条平衡和第二相(SDS-PAGE)
- 平衡时间应该充分长(至少 2 x 10 分钟)
- 平衡缓冲液包括 Tris-HCl(pH8.8),SDS(1%),高浓度尿素(6M)和甘油(30%)提高蛋白质的溶解度并减少电内渗。 第一步加入 DTT(1%)是为了使蛋白去折叠；第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的 DTT(银染过程中，DTT 会导致点拖尾)
- 对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白，相对于 DTT 和碘乙酰胺，tributylphosphine 更有效
- 水平的 SDS-PAGE：浓缩胶中加入大量的甘油(37%)是为了减少电内渗
- 水平的 SDS-PAGE：浓缩胶的长度至少超过 25mm
- 蛋白从一向(IPG 胶条)到二向(SDS 胶)的转移为避免点拖尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行(场强<10V/cm)
SDS 胶垂直拖尾的可能原因 解决办法 水平 SDS-PAGE：浓缩胶长度太短 有效的浓缩胶长度>25mm 蛋白没有被 SDS 充分包裹 平衡缓冲液 SDS 浓度>1%，平衡 2 x 15分钟 糖蛋白 *用硼酸缓冲液代替 Tris 缓冲液
*用宽范围小孔梯度胶
*蛋白去糖基化部分自由的巯基再次氧化生成二硫键聚合物 *平衡缓冲液中加入充足的 DTT，使蛋白烷基化
*用 tributylphosphine 代替 DTT和碘乙酰胺蛋白发生氨甲酰化 *含有尿素的溶液加热温度不能超过 37°C
*使用前，尿素去离子化(deionize urea)样品制备时，内源的蛋白酶没有被抑制 *TCA-丙酮处理使蛋白酶失活
*加 SDS 或蛋白酶抑制剂一起煮沸GelBond PAG 膜使用前没有清洗 使用前，用去离子水洗 6 x 10 分钟 灰尘或多余的 DTT *过滤所有的缓冲液
*第二步平衡缓冲液中加入碘乙酰胺去除多余的 DTT双向电泳图谱部分变形的可能原因 解决办法 IPG 胶条中 NP-40 或 Triton X-100浓度过高 *如果可能减少 NP-40/Triton 的量
*用 CHAPS 代替 NP-40/Triton蛋白从一向到二向转移完成后，IPG胶条没有从水平的 SDS 胶上取走 *第二向采用水平 SDS-PAGE 时,蛋白从一向到二向转移完成后，取走 IPG 胶条 缓冲液条没有覆盖 SDS 胶上原 IPG胶条结合的位置 第二向采用水平 SDS-PAGE 时，取走 IPG 胶条后，将缓冲液条前移，恰好覆盖 IPG胶条与 SDS结合位置的前沿 溴酚蓝迁移前沿不平的可能原因 解决办法 水平 SDS-PAGE ：冷却板和GelBong PAG 膜之间有气泡 去除气泡 水平 SDS-PAGE：缓冲液条和胶面结合不好 轻压缓冲液条，使其与胶面充分结合 SDS 小孔梯度胶灌胶和聚合时不水平 采用水平台灌胶 银染
- 使用纯度高(分析级)的化学试剂
- 使用高纯去离子水或双蒸水(电导<2uS)
- 使用干净无灰的容器
- 不要用手去碰胶，带手套或使用镊子
SDS 胶上只能看见很少(或没有)蛋白的可能原因 解决办法 样品制备方法不合适(蛋白浓度低) 做双向电泳前，估计样品中蛋白浓度 蛋白进入 IPG 胶条不充分 采用低电场强度开始 IEF IPG 胶条和 SDS 胶之间结合不好 轻压 IPG 胶条，使其与 SDS 胶充分结合 蛋白从一向到二向转移效率低 采用低电场强度进行蛋白转移；用去污剂提高蛋白的溶解度 IPG 胶条 GelBond 面与 SDS 胶结合 水平 SDS-PAGE：IPG 胶条胶面朝下 银染方法不正确 检查方法 甲醛氧化 用新的甲醛 显色液 pH 值不正确 检查显色液 pH 值 SDS 胶上丢失低分子量或高分子量蛋白的可能原因 解决办法 低分子量蛋白没有被充分固定 用 20%TCA 或戊二醛代替 40%乙醇和10%乙酸 蛋白酶降解高分子量蛋白 使样品中内源性蛋白酶失活 高分子量蛋白从一向到二向转移效率低 采用低电场强度进行蛋白转移 胶的背景脏 解决办法 样品中内源性蛋白酶没有失活 使样品中内源性蛋白酶失活 银染中清洗步骤不充分 进行足够次数的清洗步骤 两性电解质和 SDS 或其它去污剂形成的复合物 胶固定的时间>3 小时或过夜，充分清洗去除复合物 试剂质量差 使用分析级或更好的试剂 水的质量差 电导<2uS 水化盘或胶条槽被蛋白污染 彻底清洗水化盘或胶条槽
