关键词:
DNA 扩增 • FTA 室温• FTA纯化试剂• WGA • Genomiphi •DNA

Whatman™ FTA技术为DNA的储存和制备提供了一种前所未有的方法，利用FTA技术获得的DNA样品可以直接用于扩增。

Whatman FTA产品是野外核酸采集、运输、储存和纯化最简单、有效的工具，并且适用于各种样品来源。无论是动物、植物还是微生物细胞，只需直接将样品滴加到FTA卡上，卡片上的化学物质就会裂解细胞、失活蛋白并捕获核酸（图1）。在整个处理过程中，传染源也会被失活。样品干燥后，卡片上的核酸被保护免受酶、微生物、氧化剂和自由基的损害。样品能在室温下保存数年（目前为止FTA卡上的血样已被保存17年之久）。

在需要分析或使用储存在FTA卡上的DNA时，只需用打孔器从卡上取一个小圆片下来，用FTA纯化试剂洗去FTA上的杂质，结合在小圆片上的纯化的DNA就可以直接用于PCR扩增、限制性酶切反应或其他研究方法。然而，有一些研究需要用到大量的DNA，远远超过了小圆片上结合的DNA甚至是整个样品中含有的DNA；还有一些应用需要研究多个序列片段，即使多重PCR也无法满足需求。过去，为了满足这些应用需求，需要从更大的样品中提取DNA。全基因组扩增（WGA）技术为从小样品中获得无限量DNA提供了解决方案。

用于全基因组扩增的GenomiPhi DNA扩增试剂盒利用Phi29DNA聚合酶和多链置换机制，能够从ng级线性DNA模板中扩增得到mg级高分子量拷贝。只需保存在FTA卡上少量的DNA就能扩增得到足够多个SNP分析和其他下游应用的DNA。（详细参见www.gelifesciences.com/genomiphi）这个应用资料提供了一个利用GenomiPhi扩增在FTA卡上储存、纯化的人基因组DNA的实例。

图 1. 滴加了血样的FTA卡

方法

依照如下的FTA标准流程操作，将新鲜的指尖血滴加到FTA卡上，自然干燥。样品在室温下避光储存5周，在加样区用Harris取样器取1.2或 2.0 mm 直径小圆片，在未加样的区域取空白圆片作为对照。所有圆片在200 μl FTA纯化试剂中洗3次，每次5分钟，再用200 μl TE-1 (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH8.0）洗2次，每次5分钟。

标准GenomiPhi扩增流程：将清洗过的小圆片分别加到9 μlGenomiPhi 样品缓冲液中。扩增前，在对照组圆片中加入20ng纯化的人基因组DNA，样品在95ºC孵育3分钟后置于4ºC3分钟。每管中加入含有1 μl 聚合酶的10 μlGenomiPhi反应缓冲液。简单混匀每管内容物，30ºC孵育过夜（约16小时），然后置于65ºC10分钟，最后储存于4ºC。

从每管中取 4 μl样于含有EB的0.6%琼脂糖凝胶上电泳。

推荐操作流程

1)样品常规保存于FTA卡上，避光储存在干燥室温条件下。
2)用打孔器取小圆片 (血样1.2 mm) 放入管中。
3)用200 μl FTA 试剂洗小圆片3次，每次5分钟。
4)用200 μl TE-1中吹洗圆片2次，每次. 5分钟。小圆片被完全脱色。
5)将小圆片在室温下干燥1小时 (可选)。
6)每管中加入 10 μl (如果圆片是湿的，加 9 μl）GenomiPhi样品缓冲液。
7)95ºC孵育3分钟后转置于冰上。
8)如需要，快速离心以收集冷凝物。
9)加10 μl GenomiPhi反应混合物（含有 1 μlPhi29聚合酶）混匀。
10)30ºC孵育过夜（约16小时）。
11)65ºC孵育10分钟，储存于4ºC。

结果

Lane M:1 kb DNA ladder
Lane 1:阳性对照DNA (非 FTA法)
Lane 2:阴性对照(无 DNA 或 FTA)
Lanes 3-5 : 扩增1.2mm 样品小圆片
Lanes 6-8: 扩增2.0mm 样品小圆片
Lane 9:扩增 1.2 mm 对照 (未加血样) 圆片 加阳性对照DNA
Lane 10:扩增 2.0 mm 对照 (未加血样) 圆片 加阳性对照DNA

图 2. 在FTA卡上获得的人基因组DNA扩增后凝胶电泳图

图片显示，在此试验中，从FTA卡上截取的1.2mm小圆片上捕获的人基因组DNA，经GenomiPhi扩增有明显条带（3~5泳道），而2.0mm圆片上的DNA扩增失败（6~8泳道）。加入了DNA的1.2mm和2.0mm的FTA对照圆片（清洗过）同样被扩增（9和10泳道）。

在另外2组试验中，从保存有人DNA（来自于血样）的FTA卡上取1.2mm圆片扩增后有明显条带，而2.0mm圆片扩增后没有条带（数据未展示）。但是GenomiPhi成功扩增了结合于较大圆片上的口腔细胞DNA，并且清洗过的圆片并没有抑制对照组DNA的扩增。这表明，结合在较大圆片上的DNA模板可能过量，从而抑制扩增。

结论

保存于FTA卡上的人血样DNA可以用GenomiPhi进行全基因组扩增，这种方法集合了FTA在采集小样本、室温下安全储存和节约成本等方面的优点，以及全基因组扩增在需要大量DNA的应用中的优势。

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