尽管目前存在许多商品化的转染试剂可供研究人员选择，但转染依然是研究过程中会遇到的主要障碍。而效率和毒性就像是硬币的两面，在选择的时候往往会遇到许多问题。原代细胞由于更接近活体组织，所以也显得更加珍贵，同时要成功的转染也非常的困难。要成功地将质粒DNA或RNA转进细胞，除了挑选合适的转染试剂以外，还需要特别注意转染试剂的毒性和转染效率。对某种细胞低效率或高毒性的转染试剂可能会破坏整个实验计划。转染还会面临一些其他挑战，比如怎样防止DNA被降解、如何更高效的将DNA转入细胞核内。这都是一种优秀的转染试剂需要解决的问题。
目前还没有一种全能的转染试剂，在所有核酸、所有的应用和所有细胞系中都表现得非常优秀。DNA转染产品的制造商也一直在努力的研发一些针对不同应用的转染试剂。
如何优化转染效率？
高效的核酸转移是转染的目标，但这必须考虑其细胞毒性。在转入DNA和其对细胞的毒性之间也存着一种平衡。但转染对细胞来说就是一次损伤。
转染的最终目标是获得稳定且高效的基因表达，并且维持细胞的正常。理想的转染试剂必具备高转染效率、低毒性和好的可重复性。不同的细胞类型有不同的转染特性，通常建立的细胞系比原代细胞更容易转染。此外，DNA质粒本身的性质也可以影响转染效率。
“对于每一个新的细胞系和核酸的转染组合，进行优化以达到最高的效率是非常重要的。这个是和研究者选择怎样的转染试剂无关的，”Qiagen公司全球高级产品经理Constanze Kindler博士说。Qiagen公司也是一家提供转染试剂的制造商。包括非脂质体试剂Effectene和Attractene。“将GFP转入Hela细胞要比共转染3种不同的质粒到原代细胞中容易得多。对于前者来说，95%的转染效率并不稀奇，但对于后者，10%的转染效率可能就会让研究人员心花怒放。
要比较各种产品之间的转染效率，有必要设立一种可靠的比较方法，比如在相同的条件下使用相同的细胞系、相同的核酸。实验人员应该遵照各种试剂的使用说明，否则可能会影响转染效率。
“成功的转染取决于许多因素，对于特殊的细胞系和质粒结构，必须制定相应的转染策略。”Roche全球产品经理Cordula Jany博士如是说。Roche Applied Science已经推出了两款用于将DNA转入真核细胞的转染试剂。X-tremeGENE具有多种组分，对多种细胞均具有较高的转染效率，并且该转染试剂在转染效率和细胞毒性间已找到理想的平衡点。
除了转染试剂以外，还有其他因素会影响转染效率。比如血清、污染、传代次数，以及载体的种类和质量等。加入血清可以促进细胞生长，但却存在内毒素污染的可能。而且不同批次的血清也可能存在批间差。Qiagen建议在开始实验之前先用少量血清和对照细胞做一下对比实验。转染试剂是否可以和血清公用，否则会降低其转染效率。细胞也可能在培养过程中被细菌和支原体污染，从而影响细胞的健康和转染效率。
在细胞转染中传代次数是经常被忽略的一个因素。理想情况下，传代次数应少于50次。传过很多代的细胞会改变生长行为、形态和转染效果。转染需要高质量DNA,且DNA不含有RNA、蛋白质、基因组DNA和细菌胞内体。超螺旋质粒DNA和线性DNA相比，转染效率相对较高，但线性DNA更容易整合到细胞基因组中。如果载体质粒表达过多对细胞有毒的蛋白质，该质粒就可能存在细胞毒性。
什么是细胞毒性？
少量的细胞会将外源DNA整合到他们自己的基因组当中，以期达到稳定转染的目的，此时，细胞毒性往往会被忽略，但这一点在原代细胞转染过程中却是一项非常艰巨的工作。
如果在转染之后出现细胞毒性，可以考虑以下处理方法。如果不是细胞和DNA质量问题（可以通过对照组看出），可以先优化一下DNA和转染试剂的比例。一旦找到最佳比例，应当减少转染试剂的量，以及缩短孵育时间，以减少毒性的影响。
“然而转染总是伴随有细胞毒性的” Life Technologies公司产品经理Kurt R. Yardley博士说。“有些可能是由于在准备质粒DNA是混有了盐类或者内毒素，也可能是脂质体和DNA的混合比例没有优化好”，Life Technologies公司的Lipofectamine LTX转染试剂则在转染效率与毒性之间达到了一种平衡。
Mirus Bio公司副总经理Scott Hayes说“考虑到最高的效率并一定能得到最好的实验结果，许多商品化的转染试剂均称它们的产品具有高效率，但也具有一定的细胞毒性。因此，在分析特定的细胞信号转导通路时，可能由于诱导细胞凋亡或细胞应激反应，而使得出错误的结论。”Mirus Bio公司推出了“低细胞毒性”产品，它们的第一款转染试剂TransIT-LT1，其中LT正是低毒性（Low Toxicity）的缩写。
是否需要电转？
Life Technologies公司还提供一套电穿孔转染系统，即Neon Transfection System。电穿孔是在含有DNA和细胞的缓冲液中产生一个适当的电压和持续时间的电场，电场可以在细胞表面打孔，DNA得以进入细胞。电穿孔非常灵活，在大多数细胞类型中具有良好的效率。与转染相比，它需要大量的DNA，并且可能直接在完整的组织上完成。然而，强烈的脉冲可以破坏细胞，一些孔道可能会变得太大，以至于转染后不能关闭。
电穿孔无法精确定位特定的DNA，因为各种细胞膜的电稳定性并不相同。如果破坏了离子平衡就可能会伤害细胞。
阳离子脂质体及相关产品
除了电穿孔外，大多数转染试剂是阳离子脂质，通过形成内涵体被细胞吸收。内涵体在细胞内释放DNA载体。
Genlantis，Gene Therapy Systems公司的一个部门，除了NeuroFECT试剂以外，其生产的转染试剂均基于阳离子脂质体。GenePORTER、neuroPORTER、BaculoPORTER专为各种细胞类型和应用而定制。NeuroFECT是Genlantis转染试剂中唯一的聚合物，它专门用于转染神经细胞，特别是那些对脂质体转染敏感的细胞。
Genlantis客户代表Larissa Karnaoukhova说“还是会有许多细胞非常难转，比如原代细胞和神经细胞。我们所有的产品均附有详细的产品使用说明，说明中会建议您如何达到最高的转染效率且降低细胞毒性。”
Polyplus-transfection的转染试剂jetPRIME是新一代的阳离子试剂，它与DNA结合成带正电的复合物，通过内吞作用进入细胞。DNA/jetPRIME复合物在内涵体内像“质子海绵”，结果导致内涵体肿胀和破裂，并将复合物释放进入细胞质中。
Polyplus-transfection公司总经理Anne-Lise Monjanel说“使用jetPRIME做细胞转染将非常的给力，与竞争对手相比，我们会使用更少的转染试剂和DNA。并且转染过程非常的温和，不会对细胞造成损伤，而且花费也非常低。”
当选择转染试剂时需要注意一点，就是确保该试剂对您要转染的细胞类型进行了优化。许多试剂生产商均称其能转染的细胞类型广泛，在购买前应咨询厂家，对你的细胞类型是否适用。如果是要做敏感的原代细胞转染，那找到一款已经有成功转染记录的转染试剂就显得尤为重要。高的转染效率往往伴随着高的细胞毒性，明智的做法是最大限度的降低确细胞毒性的同时再选择转染效率高的产品。
