概述

Spallanzani（1776）最早发表了冷“处理”对“细胞”生命活动影响的报道，他用雪冷冻玻璃瓶中的马精子10多分钟之后，再将玻璃瓶放回室温下，发现了一个令人惊奇的现象，那些原本已经不动了的精子又“复活”了，就好象是刚从输精管排出来的一样，冷处理延长至数十分钟，情况依然如此。于是，他认为冷不能杀死精子。大约100年以后，许多早期的学者重复了低温处理对精子活动的影响，同样得出了相似的结论。到1900年前后，科学家基本上肯定了生物成分（如精子和一些生物化学物质）能够在零下温度贮存的事实。

Shettles（1940）证明人类的精子也能抵抗温度的突然变化，他将人的精液封闭在小管内，在-79℃～-196℃之间的低温条件下进行冷处理，发现有10%的精子仍然能够存活。此后，冷冻处理研究材料的范围大大拓展。

Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith（1961）等学者的继续和发展。

1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。

冷冻保存与复苏原理

在低于-70℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当条件下复苏。

水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤或称溶液损伤。当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。

冷冻速率

冷冻速率是指降温的速度，直接关系到冷冻效果。细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至-50C时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；当被冷至-5～-150C之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分向外流动的情况也不相同：如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会发生结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；如果冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状态（玻璃化冷冻）。Luyet（1973）证实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，溶液中的分子呈有序排列；另一种情况是非晶体即玻璃化，液体中的分子呈无序状态，保持未凝固前的状态。

不同的冷冻速度既然能使细胞内发生不同的生理变化，也可以对细胞产生不同的损伤。当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较到冰晶，造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。超快速玻璃化冷冻对细胞存活来说是最为理想的冷冻方法。细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不致造成损伤，细胞也不会在高浓度的溶质中长时间暴露而受损。

不同细胞的最适冷冻速率不同。小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞的最适冷冻速率分别为1.60C/min、70C/min和2000C/min。细胞与细胞之间的最适冷冻速率可在1.60C～3000C/min，故对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。

冷冻保存温度

冷冻保存温度是指能长期保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和功能。

不同的细胞和生物体以及使用不同的冷冻保存方法要取得同样的冷冻保存效果，冷冻保存温度可以不同。但从实际和效益的观点出发，液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。在-196℃时，细胞的生命活动几乎完全停止，但复苏后细胞的结构和功能完好。如果冷冻过程得当，一般生物样品在-1960C下均可保存十年以上。应用-700C～-800C保存细胞，短期内对细胞的活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显降低。在冰点到-40℃范围内保存细胞的效果不佳。

复苏速率

冷冻保护体外培养物，除了必须有最佳的冷冻速率、合适的冷冻保护剂和冻存温度外，在复苏时也必须有最佳的复温速率，这样才能保证最后获得最佳冷冻保存效果。

复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说，复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1-2分钟内完成复苏。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。

冷冻保护剂

冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。冷冻保护剂常常配制成一定的溶液。一般来讲，只有红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳动物细胞悬浮在不加冷冻保护剂的水或简单的盐溶液中，并以最适的冷冻速率冷冻，可以获得活的冻存物。但对于大多数有核哺乳动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冷冻物。例如将小鼠骨髓细胞悬浮在不加冷冻保护剂的平衡盐溶液中，并以0.3～6000C/min的冷冻速率降温冷冻，98%以上的细胞会死亡；而加入甘油冷冻保护剂进行冷冻保存时，98%以上的细胞都可存活。

冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不防止细胞内结冰，在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等成分渗透到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前DMSO的应用比甘油更为广泛，但要注意的是，DMSO在常温下对细胞的毒性作用较大，而在4℃时，其毒性作用大大减弱，且仍能以较快的速度渗透到细胞内。所以，冻存时DMSO平衡多在4℃下进行，一般需要40～60分钟。

非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其保护机制的假说很多，其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。

不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保护剂（如DMSO）在低温下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温后应及时洗涤冷冻保护剂。

冷冻保存方法

按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化和玻璃化冻存两种。非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降温至-70℃～-80℃，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-1000C以下，再直接投入液氮保存的方法。以该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形成。玻璃化冻存则是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法。以该中方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成。但目前细胞冻存最常用的仍是前一种方法。

非玻璃化冻存方法

下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。

主要材料

（1）仪器设备：普通冰箱、-30℃低温冰箱和-70℃～-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；

（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；

（3）冷冻保护液：一般是以9份小牛血清或细胞培养液与1份DMSO混合而成。现配现用，或配制后防入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴溶解；

（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。

操作过程

1、待冻存细胞悬液的制备

（1）按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；

（2）将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；

（3）向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；

（4）按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；

（5）再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。

2、分级冷冻

（1）先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），约40min；

（2）接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-10℃～-20℃），约30～60min；

（3）将冻存管转入低温冰箱（-30℃），放置30min左右；

（4）然后将冻存管转移到超低温冰箱（-70℃～-80℃），过夜；

（5）最后将冻存管投入液氮保存。

3、记录

做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

冻存结果

如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

讨论

在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。

在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。

应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。

冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-1960C的液氮中取出冻存管，立即投入37～40℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。

玻璃化冻存方法

以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法（Takhashi et al. 1986）。

主要材料

（1）冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH调节pH至7.4，现配现用。

（2）冻存管：SILASTIC玻璃小管，内径3mm，外径4.5mm；

（3）设备：液氮储存罐；

（4）待冻存细胞：人类外周血单核细胞。

冻存过程

（1）用常规方法分离全血中单核细胞；

（2）在冰浴中预冷冷冻保护液；

（3）将装有单核细胞的离心管放置入盛有冰水的烧杯内（冰浴）；

（4）沿离心管壁缓慢滴加预冷的冷冻保护液。滴加过程为：前3min以0.3ml/min速度滴加，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的冻存液以0.75ml/min速度滴加。2×107个细胞要滴加15ml冻存液。滴加的时间在15min左右。最终细胞密度要在1×106～1.5×106个细胞/ml，边滴加边轻轻晃动离心管；

（5）轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液；

（6）将细胞冷冻悬液分装于冻存管中。12cm长的冻存管装0.8ml细胞冷冻悬液；

（7）将冻存管两端以火焰封口；

（8）最后将冻存管直接投入液氮中保存。降温速度约为6000C/min。

冻存结果

如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

讨论

玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。

因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性（但在4℃时毒性大为减弱）。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在4℃冰浴中进行。另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡。

冻存细胞的复苏

非玻璃化冻存的复苏方法

主要材料

（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；

（2）培养用液：完全培养液。

复苏过程

（1）调配37℃～40℃的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37℃～40℃；

（2）从液氮中取出冻存管，立即投入37℃～40℃ 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；

（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；

（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；

（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。

结果

复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

玻璃化冻存的复苏方法

以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashi et al. 1986）。

主要材料

（1）设备：高速离心机；

（2）培养用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液、培养液。

操作过程

（1）将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；

（2）将冻存管两端剪断，可以将5ml细胞冻存悬液转移到50ml离心管中；

（3）沿离心管壁缓慢加入已在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡盐溶液。前10min以0.2ml/min的速度加入，后10min以0.5ml/min的速度加入，接着的15min以0.75ml/min的速度加入，最后30min以1ml/min的速度加入。全过程约为65min，都在冰浴中进行；

（4）将稀释后的细胞悬液以400r/min离心5min，去除上清。向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。

结果

复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

讨论

复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。

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无觅

无血清培养基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。因此研制出无血清培养基一直是生物科学工作者努力的目标。

无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。 用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。

添加组分

1.促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。

2.促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。

3.酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。

4.结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。

5.微量元素：硒是最常见的。

使用方法

目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。

为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：

1.处于对数生长中期

2.>90% 活细胞率

3.适应时以较高的起始细胞接种

细胞适应无血清培养基的方法

1.直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。

一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天，当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

2.连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。

（1）以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM 混合培养基中，传代培养。

（2）当细胞密度>5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。

（3）以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SFM中传代培养。

（4）当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml（接种后4到6天），在100％SFM培养基中传代培养。

（5）每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。

在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。

细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。

培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。

特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。

无血清培养基的优点

1.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。

2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。

3.避免血清组分对实验研究的影响。

4.有利于体外培养细胞的分化。

5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。

缺点：

1.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。

2.成本较高。

3.针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。

无血清培养基一些配方

1.神经细胞，干细胞，PC12细胞

成份 终浓度

葡萄糖－－0.6%

谷氨酰胺－2mM

NaHCO3－－3mM

Hepes －－5mM

胰岛素－－2.5μg/ml

转铁蛋白 －100ng/ml

孕 酮 －－20nM

丁二胺－－60μM

硒酸钠－－30nM

青霉素－－50mg/ml

链霉素－－50mg/ml

最后用DF12添加到100ml即可

2.各类小鼠胚胎癌细胞系培养基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO3 2.4g

HEPES(1.5M) 10.0ul

硒酸（5*10-6M) 10.0ug

纤粘连蛋白 1ug/cm2(37度作用15－30分钟）

胰岛素 1000.0ug

转铁蛋白 5000.0ug

3.NIH3T3小鼠成纤维细胞培养基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

HEPES 15mM

大豆胰酶抑制剂 0.1％

胰岛素 10.0ug/ml

转铁蛋白 25.0ug/ml

纤粘连蛋白 5.0ug/ml

4.杂交瘤细胞培养基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO3 1.2g/L

HEPES 15mM

胰岛素 5.0ug/ml

氨基乙醇 20.0uM

硒酸 2.5mM

转铁蛋白 35.5ug/ml

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无觅

一、血清灭活问题。

1、问：加到培养基中的血清必须灭活吗？

答：不是必须的，看做什么实验了。

2、问：四季青胎牛血清灭活是56℃30分钟吗？

答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

3、问：我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗？

答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。

4、问：我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗？因为血清中可能有些补体和抗体，是不是会影响转染？我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗？细胞是单核细胞白血病细胞，病毒是病毒包装细胞PT67收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么？

答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活！这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。

5、问：(1)我买的是杭州四季青的新生牛血清，要灭活吗？有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培养基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有关系吗？

答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响。

我在实验室处理血清的时候，有一次水浴箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80℃，血清变成了凝胶状，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染，常常又会把血清放置37℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验，非常麻烦。

我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5)的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。

你可以摸索一下，血清从-20℃冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。

问：(2)分装后的血清从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗？

答：正常。

二、血清的保存问题。

1、问：2006年6月到期的GIBCO胎牛血清到2007年5月还能用吗？

答：只有试试了，如果一直在-20℃冻着来者，应该还可以，先少用点看看。养细胞系应该没问题，原代不行。

2、问：请问我自然溶化好的胎牛血清和1640培养基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室温下一晚行吗？100毫升培养瓶加多少培养基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、问：4℃冰箱内保存3个月的胎牛血清，能否继续使用？相关细胞和其它试剂的代价比较高，不敢轻易尝试。

答：需要长期保存的胎牛血清必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中，4℃冰箱中保存时间不要超过1个月。

三、血清灭活时温度问题。

1、问：因为实验室水浴锅失控，血清灭活时，温度到了61.7℃，这血清还能用吗？

答：多长时间啊？短时间应该可以吧，我有一次加热了一个多小时，还照样用。

2、问：我灭活胎牛血清时，用的电磁炉，定在了70℃，本来说调温度到56℃再放血清的，后来忘了，就把血清放进去了，所以灭活的温度肯定超过56℃了，不知道这样对血清有没有影响？

答：常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等，其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。看看你养的细胞是什么，一般的话估计问题不大，要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质， 在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。现在好像不主张热灭活，热灭活经常给血清产品带来负面影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，此外，有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

四、FBS可否代替人AB型血清？

问：我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养，文献上要求用人的AB型血清，但是我觉得很多代理商都没有。我想FBS代替，但不知道可否，我先是担心免疫排斥之类，但是我查了些资料后，应该不会(我觉得)。但是我又不能够TRY。因为细胞因子确实太贵了，所以咨询一下。谢谢！

答：你最好照文献的做。除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂)。细胞培养的影响因素很多，特别是培养基的成分。

五、血清的制备方法问题。

1、问：我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞，有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备过程？

答：自己制备血清当心污染啊。如果无菌条件好的话，用静置析出方法就行。

2、问：一般我们用得胎牛血清用前还要灭活，我想用大鼠的血，不知道要不要灭活？

答：你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜，离心，取上清，在无菌过滤，也可灭活，然后分装冻存，用时再配。

3、问：如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤？

答：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。灭活一般不会对血清中的一些因子损伤的。

六、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问：在进行心肌细胞原代培养时，需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清10%的培养液，但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的，想问一下，1%的是否可以，效果是否有保证？这样确实能节省不少血清的。

答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。 10%的FBS完全培养基效果都不太好，开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右，但这就有出现另一个问题，在FBS完全培养基中，成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长，纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用，有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问：我胰酶的用量是0.08% ，并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊，难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗，还有，我的BRDU只用到48小时就不用了，因为担心其损伤太大，可以持续用多久呢？

答：我用10%FBS终止的，然后差速1h，然后还是用10%FBS的HG-dmem养的，没有用brdu，心肌细胞还是比较多和稳定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就会有搏动。

七、血清和培养基的种类及品牌问题。

1、问：细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢？周围有人用PAA或Hyclone的，这两种跟Gibco或sigma出品的差别大吗？

答：如果是长得非常快得细胞如pa317，293，c6等恶性肿瘤细胞，一般得国产血清就可以，如果是原代培养的细胞，最好应用胎牛血清或类标准胎牛血清，Hyclone公司血清的质量不如GIBCO(同类血清)。国产的杭州四季青和甘肃民海（中美和资）不错。有些细胞(如：sf9，293还有其他一些元代细胞)，用Gibco的比其他两种好很多，会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的还要看产地。

2、问：最近要订一瓶胎牛血清，实验室之前都在用小牛血清，没有买过胎牛血清。请问哪个公司的好一些？问过试剂公司，有两种：一种是PAA的(分普通级和优级)，一种是Hyclone的(只有普通级，而且是新西兰产的)。试剂公司推荐使用PAA优级的，但看好多文献都用Hyclone的，公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请问用的哪种胎牛血清比较好？

答：民海的效果还不错，要是不放心国产的，那就买进口的。进口的好多公司都有，新西兰产的效果一般。Hyclone和Gibco的都还可以。民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错。

3、问：四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别？培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些？

答：用无支原体胎牛血清就可以啦。

4、问：SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清？

答：我一直用GIBCO的1640，你可以买含HEPES的1*10L的包装，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。请查阅： www.atcc.org

八、牛血清污染噬菌体的问题。

1、问：有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染，以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够除去噬菌体？

九、培养基血清浓度问题。

问：在1640里加血清时加多了，90ml里加了20ml血清，约为18%，以前都是加10ml的，查了网上多建议用10%-15%，有关系吗？

答：我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大，建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大当然细胞状态感觉要好，但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟癌细胞很好。

十、问：MTT加药的时候加不加血清？加药时要用无血清的培养基吗？

答：我的药就是用含血清的培养基稀释的，不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用，无形中对细胞造了一个serum-free的模型，细胞在提内本来就是有血清供应，如果该药物都不能对抗，那该药物就没有什么临床价值了，这是我的理解。

十一、PC12细胞培养所用血清问题。

问：我正准备购买上海细胞所的未分化的PC12细胞，需要灭活的马血清，可现在买血清很困难，好像是海关有封锁，代理商这么说的，我原定购买的Gibco的horse surum，现在无法买到了，好容易找到一个目前可以进血清的公司Hyclone，有一种Donor Equine serum是马血清吗？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是这个。我当时是在鼎国(重庆办事处)买的，100ml大概140元，具体不记得了。当时是看它比别的进口的马血清便宜。另外：我买了以后灭活的。

十二、AB血清的制备问题。

问：本人想从人的外周血中分离AB血清的，用于B淋巴细胞的培养。谢谢大家给点建议。人的血，来之不易啊。

答：是AB血型人的血清吗？这种血清即没有抗A型抗原抗体，也没有抗B型抗原抗体。分离血清时将采集的血液注入试管中，待血液凝固后离心分离血清。可将采集的血液放在37℃水浴箱中促进血液凝固，减少凝固时间。离心可在2500～3000rpm，10min，足可以分离血清。分离后将血清吸出保存即可。分离血清的量可按采集血液的50%左右计算，因为红细胞占总血液的50%左右。当然整个过程要注意无菌操作。

十三、Gibico的胎牛血清内是否含糖？

问：我想做糖诱导细胞凋亡的试验。细胞培养液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖对我实验的培养液糖终浓度影响比较大。今天打电话问GIBCO公司的技术顾问，回答我糖浓度少于5μg/ml，因此基本可认为是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我们医院检液科，结果却是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。难道是检测人血清的血糖浓度的方法不能用于检查牛血清吗？(另起茶水验尿事件？)检验科没有给我回答。

答：应该是不含糖的。请参照gibco的网站：http://www.invitrogen.com/content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五页我做了个记号。直接点击链接就可以看到它的说明书页面。我想我们肯定要以公司的说明书为准。至于为什么检验科测起来有误差，我想可能是样本不一样，需要用标志品矫正有关。具体需要检验科的战友解释了。

十四、血清或培养基产生了颜色或沉淀的问题：

1、问：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分钟灭活后出现了白色少量絮状沉淀，是不是污染？还能不能再用？血清的生产日期是2006年7月(现在是2007年6月11日)。

答：应该问题不大。你可以取少量血清放入培养皿中，37℃过夜培养看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

2、问：我用MTT法测细胞的增殖，用DMSO裂解细胞，发现把DMSO加入到孔中就会形成乳白色(用的含胎牛血清的1640培养基，由于没有离板子的离心机，所以没有去除培养基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培养基没有看到有这种情况。该怎么解决？

答：为什么要用离心机离心呢？难倒你养的是悬浮细胞吗？如果是贴壁细胞的话直接将MTT倒掉，再加DMSO即可，我们就是这么做的，效果很好！并且测细胞的增殖的话如果不去掉MTT就加DMSO的话误差应该很大！有时不一定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的时间或以及其他成分有关！

3、问：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解冻后没有混匀直接分装，结果使得前面的几管是清亮的，后面就带有棕色的，不知有没有影响？估计有什么影响？前面的成分好还是棕色的成分好啊？

答：肯定有。最好还是重新混合重新分装，我觉得有效成分会集中在棕颜色部分。

问：(2)为什么会出现棕色呢？

答：血清中的棕色多一些可能是因为红蛋白的含量高些的缘故吧。

问：(3)血清灭活之后可以存放吗？我的是前天灭活的，但是没有加到培养基里，而是放在冰箱里，那下次可以直接用吗？还是再次灭活啊？

答：当然可以，如果多的话，分装后最好放在－20℃，下次用时再解冻，也不用再灭活。最好用一管拿一管，少许血清可以放在4℃。分装时还要注意不要装得太满，以免溢出污染。

十五、污染和过滤的问题。

1、问：怀疑血清染菌，想用滤膜过滤一下，可否自己用0.22μm滤膜过滤？对血清性质有多大影响？有做过的么？

答：可以过滤的，血清当出厂时都是0.22μm或0.1μm过滤除菌。想证明有没有染菌不用过滤这么麻烦，只要放置于37℃过夜就可以了，如果有微生物污染会变浑浊的，如果还是澄清的就说明没有问题的。实验室中血清很难直接过滤，一般要加到培养基中再过滤。我们实验室制备培养基时，都使用滤膜过滤，一般而言如果制备1-2瓶培养基，一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛血清。如果大量制备培养基也可以将血清加到培养基中，使用0.22微米的大滤膜一起过滤。

2、问：我怀疑我用的完全1640培养液被污染了，准备重新过滤消毒，过滤后是否需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：完全1640培养液被污染了，如果是支原体的话，过滤没有作用，支原体可以通过滤膜。我们用1640液，都是配液后保留500ml，然后其他的分装100-200ml，现用现配因为血清比1640要贵，如果你想过滤的话，建议你加原比例血清，因为血清不会很容易通过滤膜。最主要的还是找到可能污染的原因。

3、问：加好了血清双抗的培养基由于污染了再过滤后还能用吗？

答：建议不要用了。在加了双抗的情况下已经污染，那么细菌污染的可能性会较小了。一般的过滤除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、问：我准备把使用的完全1640培养液重新过滤一遍，不知道培养液中的血清成分是否能通过滤膜，过滤后是否还需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：可以透过，但是随着液体量的增多会很慢，如果不加压会比较麻烦，还有最好用低蛋白吸附的，不然损失是比较大的。

十六、问：悬浮细胞培养时能否加血清？如果加了会有什么结果？为什么悬浮细胞培养时就不能加血清？

答：血清是细胞培养基中重要的培养成份之一，对细胞生长有广泛影响。在细胞培养时，我们通常会加入10%的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要。一般说来，牛血清包括以下成分：生长因子(如激素，白细胞介素等)，他们可以促进细胞生长；贴附因子，他们可以促进细胞的贴壁，往往只有细胞贴壁才能增值(悬浮培养的细胞除外)；蛋白质(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作为营养物质，又可以中止胰酶的作用；还有很多成分不明的物质。血清还可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤。因此，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，血清是必不可少的。除非因实验要求无血清培养时，例如：为使细胞同步化时，我们会采用无血清培养的。单纯的说悬浮细胞培养不能加血清就没有太多的道理了。

十七、关于中和消化液需要的血清量。

问：用胰蛋白酶消化细胞后，需要用血清中和。具体这种中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之间的比例是多少？

答：做了很久的试验，真的没有想过胰酶和血清的对应关系。不过细想下来，这个应该也没有固定的比值。血清的品种都是不同的，成分必然有差异，如何能确定其与胰酶的比值关系？我们消化细胞的时候，如果是传代，细胞变形后，吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培，这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中止消化的。不会存在继续消化的事情。如果是从组织上消化细胞做原代培养，我一般都使用全培进行中止，而且加的很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2，一般我养细胞的时候，会用国产的比较便宜的血清配制全培，专门用于中止消化，这样有几个好处：一是中止消化的效果应该好于hanks液吧，再是也有利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉，血清便宜，离心掉了不会心疼。而养细胞的时候用好血清。个人观点，仅供参考。

十八、血清中的悬浮物问题。

1、问：发现培养的细胞瓶中背景有许多的小黑点，培养液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以为是胶原虫。本打算换液，换液前特意看了下前些天配的培养液，肉眼发现培养液中有悬浮的颗粒状物质(不多)，于是放在镜下观察，新鲜培养液中有一些悬浮的小颗粒，不多。(培养液是R1640+20%牛血清+1%双抗)于是又将分装在4℃保存的小牛血清拿出观察，肉眼可见5、6个白色小小球状的物质，在血清瓶稍靠下的部位悬浮。镜下观察，也有少量的不知什么物质的东西漂浮。小牛血清是Hyclone新西兰的，标签上写已经经过2μm滤膜过滤处理。根据上述培养液的情况，是否说明培养液已被污染？如果是正常的血清是不是在镜下不应该看到杂物，哪怕是极少量的？根据上述血清的描述，是不是说明血清也存在问题，还能用吗？补充：细胞培养以来生长状态就不好。买血清的时候厂家说明不用灭活，所以未灭活。

答：(1)血清应该-20℃保存，解冻血清时，请按照的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大实验显示非常容易产生沉淀物。

(2)血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白在血清解冻后，也会存在于血清中，亦可造成沉淀物。

(3)若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清，再放回冷冻，若存放于4℃时，请勿超过一个月，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

(4)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(5)排出了血清的原因，在考虑实验用品和无菌操作的问题。

(6)细菌病毒、衣原体、黑胶虫污染也很常见，如果细胞死的太多，影响较大建议更换培养液。

2、问：今天在配培养液时，发现血清里面有小碎片样的漂浮物，血清仍然清亮，不浑浊。不知道是什么，问了实验室的学长，说仍然可以用，但还是不放心，没有用血清。求助园子的各位达人，这可能是血清出了什么问题？我的血清用了一个月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培养液配置时Votex不够，当时是清亮的，但过一段时间会析出来；(2)真菌污染。

十九、更换无血清培养基后细胞大量死亡的问题。

问：我使用Lipofectamine2000转染成骨细胞，在转染前要换上无血清的培养基。本来条件模的好好的，转染效率也可以接受。但是寒假一回来就发生了怪事：细胞在有血清的培养基中长的好好的，一换无血清的培养基就死亡。大概4个小时就能看到较多的细胞飘起来。但是原来我换无血清培养基，就算放那里10个小时都是没问题的啊。已经换了不同批次的培养基，甚至吸管什么的都换过了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)两周后的培养液应补加谷氨酰胺，或者重新配液，转染时应不含抗生素。

(2)确认操作方法和环境，建议检查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂质体的毒性很大，如果有质粒参与对细胞损伤更大，如果Lipofectamine2000在常温放置过，对细胞更大，假期冰箱是否断过电。

(4)培养箱的温度、c02浓度，湿度。

二十、完全培养液的相关定义。

问：“完全培养液一词”，是指加了血清的培养液吗？我在做含药血清的实验，涉及到血清添加量的问题。所以想弄明白文中所指的“完全培养液”是否是含药血清。

答：原液是指配置后过滤除菌。不完全培养液是指不含有血清的原液，其他成分已补充。完全培养液是指不完全培养液加入血清后称完全培养液。

二十一、血清相关知识总结。

使用胎牛血清的注意事项：

血清是细胞培养中最重要的元素之一。下面是实验室里常会遇到的问题，仅供大家参考：

1、保存血清最好的方法：

建议血清应保存在-5℃ 至 -2O ℃ 。然而，若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损：

建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、何谓热灭活：

一般是以 56℃ ， 30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有 : 溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、关于胎牛血清的灭活：

有必要做热灭活吗？

实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！

6、血清相关知识：

如何避免沉淀物的产生？

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作 :

(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。

(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

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一、玻璃器皿的清洗

在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。

1、新购的玻璃器皿

除去包装沾染的污垢后，先用热肥皂水刷洗，流水冲净，再浸泡于1~2%的工业盐酸中数小时，使游离的碱性物质除去，再以流水冲净。对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上将水空干，即可使用。

2、用过的玻璃器皿

凡确无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用后可随时冲洗，吸取过化学试剂的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必须经过适当消毒后，将污垢除去，用皂液洗刷，再用流水冲洗干净。若用皂液未能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。洗液的主要成份是重铬酸钾和浓流酸，其作用是将有机物氧化成可溶性物质，以便冲洗。洗液有很强的腐蚀作用，使用时应特别小心，避免溅到衣服、身体和其他物品上。

二、培养基的类型

在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基（Media）。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。

1、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。

1）天然培养基 天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。

2）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。

3）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。

2、根据培养基的物理状态来区分，可以分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。

1）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。

2）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。在实验室中，它被用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。

3）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.2~1%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。

3、根据培养基的用途来区分，可分为选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基等。

1）选择培养基 在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。

2）增殖培养基 在自然界中，不同种的微生物常生活在一起，为了分离我们所需要的微生物，在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基，这种培养基常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。

3）鉴别培养基 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。

有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。

另外，根据培养基的营养成分是否“完全”,可以分为基本培养基、完全培养基和补充培养基，这类术语主要是用在微生物遗传学中。根据培养基用于生产的目的来区分，可以分为种子培养基和发酵培养基。还有专门用于培养病毒等寄生微生物的活组织培养基，如鸡胚等；专门用于培养自养微生物的无机盐培养基等。

三、培养基制备的基本方法和注意事项

1、培养基配方的选定

同一种培养基的配方在不同着作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。

2、培养基的制备记录

每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

3、培养基成分的称取

培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方面军做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。

4、培养基各成份的混合和溶化

培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢莴加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。

5、培养基pH的初步调正

因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2,而肠浸液pH却会有显着的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终PH,保证培养基的质量。PH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。

6、培养基的过滤澄清

液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显着沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。

琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至55~60°C的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2,每1000ml培养基加入1~2个鸡蛋的蛋白，强力振摇3~5分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121°C加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。

7、培养基的分装

培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3.容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有用螺旋盖者）。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。

8、培养基的灭菌

一般培养基可采用121°C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。

某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的培养基中。

琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。

9、培养基的质量测试

每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH.

将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。

用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24~48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。

10、培养基的保存

培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。

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1.建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。

2.其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。

3.根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640 。

4.用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。

表 不同细胞系适用的培养基

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一、培养基的历史

体外培养（in vitro culture）包括：组织培养（tissue culture）、细胞培养（cell culture）、器官培养（organ culture）。顾名思义，就是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或者活体器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。

体外培养已经历了约一百年的发展历史，但发展初期进程比较缓慢，没有引起很多学者的重视。直到上世纪50年代后期，体外培养技术才广泛应用于生物学研究的各个领域，使这项技术得到飞速发展。现在体外培养已成为细胞工程、基因工程、抗体工程的重要组成部分。

细胞培养指从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞，也可把体外培养细胞分散成单个细胞在体外条件下培养，细胞能继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。

发展与完善细胞培养技术围绕防止污染、改进培养方法、设计新型培养容器、设计不同的培养液等几个方面进行。

1885年Roux温生理盐水培育鸡胚组织；

1903年Jolly，1906年Beebe等发明了盖片悬滴培养；

1907年Harrison培养蛙胚神经成功，开始创建盖片凹玻璃悬滴培养法；

1910、1912年Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法；

1924年Maximow采用双盖片悬滴培养法；

1923年Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。

Earle等加以改进，使大量细胞能直接生长于玻璃瓶壁上，培养了正常细胞与肿瘤细胞的细胞株。至此大多数研究人员都采用培养瓶培养细胞。

组织培养从二十世纪40年代起迅速发展,在培养容器、培养基和培养技术等方面出现了很多革新。

在培养容器方面, 由简单的用试管、旋转管培养，发展到多种培养瓶培养，近年来，塑料瓶、皿、多孔培养板的使用已日趋普遍。

在培养基方面，从50年代初，Parke、Eagle等设计出合成培养基后，从纯天然培养基到合成培养基、从鸡胚浸出液发展到动物血清（促细胞生长物），直至60年代设计出无血清培养基。

首先反映在设计不同种类的缓冲盐溶液，以用来培养不同的细胞和洗涤细胞。Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。

在培养技术方法方面，革新进展更为迅猛，Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。

1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。

1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。

1961年Hayflick首建人二倍体细胞系25种，开辟了应用新方向。

从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。

诱变建立遗传缺陷细胞株、杂交瘤技术制备单抗、发展细胞大量培养技术、利用重组技术构建工程细胞株，已成为生物工程的重要生产手段。

在连续灌注培养工艺方面，美国Ohashi,Ryo等人2001年报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68为培养基，最高活细胞密度超过1×107cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体，稳态培养时活细胞密度超过2×107cells/ml；2004年德国Thomas等人在1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物，代谢转向TCA循环增加，活细胞密度保持在(1～2)×107cells/ml。

在流加悬浮培养工艺方面，美国麻省理工Xie Liangzhi等人2000年报道在2L生物反应器中流加培养杂交瘤细胞，通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率，补充培养基包括营养成分、胎牛血清和痕量金属，最大活细胞密度达到1.7×107cells/mL。

二、细胞培养目的与用途

1、科学研究

（1）药物研究开发，如新药筛选，疫苗、基因工程药物、细胞工程药物

研究与开发、单克隆抗体制备等。

（2）基础研究，如药物作用机理、基因功能、疾病发生机理等研究。

2、生物制药

（1）疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等)，多肽疫苗（肿瘤疫苗)等。

（2）基因工程药物生产：如EPO等。

（3）抗体药物、基因治疗药物生产。

（4）细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等。

（5）利用细胞法体外测定生物活性物质的活性；并预测其在体内的药效和替代体内法检测其成品的生物活性。

三、细胞培养基的定义

人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。包括：

1、天然培养基

指来自动物体液或利用组织分离提取的一些培养基，如动物血浆、胚胎浸出液、血清和人血清，水解乳蛋白等。

2、合成培养基

人工设计、配制的培养基，如MEM、199、DMEM、RPMI1640等。

四、动物细胞培养技术平台

动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言：蛋白治疗药物如糖蛋白、抗体和多肽药物仅仅只是刚刚开始进入市场，预计在下一个10年或20年会有更为快速的发展。届时，蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求将远远超过全世界的生产能力。

动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间，加快工业化进程。当前已获FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌注培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量；去除所有培养环境中外源因子的污染；更为精确有效的工艺控制手段；规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。

1996年1月至2002年12月美国获得成功批准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种，其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种。动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术，并逐步形成商业化操作水平。

动物细胞大规模培养技术集中在细胞系、细胞培养基和细胞生物反应容器三个方面，构成生物制品生产的必要条件。

其中细胞是病毒、蛋白的表达载体，细胞质量直接影响蛋白的表达量或病毒的滴度，故筛选、驯化优质细胞是关键。而只有好的细胞培养基才可能筛选、驯化出优质的细胞。

细胞生物反应容器也在不断发展，以转瓶、反应器为主要细胞生产设备，配合高密度培养、微载体培养、悬浮培养技术，均需要相适应的细胞培养基以充分发挥作用,获得高表达、高产量，降低生产成本。

清大天一公司致力于动物细胞培养技术的开发和服务，跟随生物技术的发展，针对各种生物制品特点不断开发针对性培养基新产品，建立多种细胞体系的疫苗、抗体药物生产细胞培养技术平台，以提高相应细胞培养水平和生物制品表达水平，促进生物制药发展。

细胞培养技术对生物制品成本的影响

1、表达量提高

通过细胞培养技术的不断改进可以充分利用现有设备，大幅度提高生物制品表达量，降低生物制品的单位制造成本；同时，由于产量提高并不新增固定资产投资，也带来生物制品的单位固定成本的降低。

因此提高表达量可以有效降低生物制品的单位成本，既降低变动成本，也降低固定成本，使得制品利润率提高，市场竞争能力增强。

2、培养液成本降低

在很多使用牛血清的细胞培养液中，为牛血清支付的成本远远高于培养液中的细胞培养基等其它成分，因此通过采用低血清细胞培养基，降低牛血清用量，可以降低细胞培养液总成本。

3、纯化成本低，制品安全性提高

牛血清的使用量不仅增加了细胞培养液的成本，更严重的是带来动物来源成分、杂蛋白，以及不安全因素，这些成分越多，纯化的成本越高、生物制品原液损失越大，生物制品的成本越大。因此采用低血清、无血清培养细胞可以有效降低纯化成本何损失，提高生物制品成品率和利润率。

4、综合成本降低

综上所述，动物细胞培养技术是生物制品产业化的核心技术之一，在生产中，应该系统、全面的研究细胞培养技术对生物制品成本的综合影响，不断追求最佳的细胞培养技术，提高生产效率，有效降低生物制品成本，提高利润率，增强产品市场竞争力。

五、细胞生存条件

1、基本营养物质

（1）糖

六碳糖主要能源、维持渗透压，含葡萄糖1-5%。

（2）氨基酸

维持生存需12种氨基酸（精、胱、亮、异亮、赖、蛋、苯丙、苏、色、组、酪、缬）。谷氨酰胺需量最大,缺乏时细胞生长不良。

单细胞培养或细胞量少时,所需氨基酸的种类和量增多，细胞主要利用左旋氨基酸异构体。

（3）维生素

细胞大部分需水溶性B族维生素，Vitc不可少，1-10mg/100ml可促进正常细胞生长繁殖。

2、促生长因子、激素类物质

3、其它物质

基本元素、微量元素、促细胞贴附物质(纤粘连蛋白、层粘连蛋白laminin、IV型胶原、氨基多糖类)

4、水

主要成分和生存环境,要求高纯度水。

5、温度

哺乳动物及人源细胞最适培养温度为35℃—37℃,对低温耐受力比高温强。39℃以上受损→死亡；不低于0℃时（0℃-34℃），细胞能生存，但代谢降低、分裂延缓。

6、气体环境和pH

需O2 、CO2，通氧量过大对细胞有毒害。

CO2 主要与维持pH有关，细胞培养最佳pH为7.2—7.4，通过缓冲系统和调节CO2含量，维持正常pH。

开放培养要求5%CO2环境、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)10—50mmol/ml可防止pH变化。

含Earle’s缓冲系统的培养基适合于5％CO2的培养条件，Hanks’缓冲系统的培养基仅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5％CO2 的环境，若放入CO2 培养箱，溶液将迅速变酸，使用时应注意。

7、湿度和光

开放培养相对湿度控制在95%。细胞培养需避光，紫外线或可见光可造成核黄素、酪氨酸、色氨酸等产生有毒的光产物，抑制细胞生长，降低其贴壁能力。

8、影响细胞生长的其它因素

接触橡胶用品、收集细胞时离心速度过大、细胞接种浓度过低等。

六、细胞培养基的基本要求

1、营养成分

氨基酸、单糖、维生素、无机离子与微量元素。

2、促生长因子及激素

3、渗透压

4、pH

5、无毒、无污染

七、细胞培养基组成及作用

1、氨基酸

组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。

必需氨基酸包括L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等。

2、维生素

维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。

脂溶性维生素如：A、D、E、K。

水溶性维生素如：B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸、生物素、C、烟酰胺等。

许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。

VA是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体，对上皮细胞有重要的维护作用。VD参与调节钙的吸收。VE是抗氧剂，可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化。VK缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长。

叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。

生物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。

3、碳水化合物

碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。

4、无机离子

钠、钾、镁、钙、磷等基本的无机离子，这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢。

培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg −320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。

Na+ 是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液，细胞内K+ 的对于激活某些酶是必需的，它在调节细胞内环境的酸碱平衡也有极重要意义。 Ca2+ 在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着，在细胞内参与许多重要的细胞生理活动，如传导、参与肌肉细胞收缩等。 Mg2+ 是构成细胞间质的重要成分，对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控的功用是十分广泛而不可缺少。

八、细胞培养基发展趋势

1、无血清培养基

是设计用来在无血清条件下促使特殊类型的细胞生长或进行专门应用的培养基。需要添加生长因子和/或细胞因子，含有个别蛋白或大量蛋白组分。其主要优点：

增加确定性；

性能更一致；

容易进行纯化和下游加工；

提高制品安全性和/或产量。

2、无蛋白培养基

培养基中没有添加蛋白，但仍然可能包含一些动物或植物来源的成分（如低分子量肽的各种水解物）。

3、化学限定培养基

培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构。

九、培养基的品质

1、外观

颜色、粉末细度须均匀。

2、溶解性

培养基完全溶解，可以避免培养基内营养成分的流失。

3、H值

哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，同时pH值的测定也可以检查培养基的批间差异。

4、水分

培养基的营养成份很丰富，利于微生物的滋长，因此水分的含量控制可以延长有效期。

5、冰点渗透压

细胞必须生活在合适的渗透压环境中；同时渗透压值的测定也可以检查培养基的批间差异。

6、菌落总数

粉末培养基不是无菌制剂，培养基本身的营养成分很丰富，容易滋生微生物，因此菌落的控制可以延长有效期

7、细胞生长试验

可检查细胞培养基是否有促生长的能力，以及是否有不利细胞生长的毒素。

8、细菌内毒素

为满足生物制品细菌内毒素的控制要求，作为生物制品生产原料的培养基同样需要细菌内毒素控制。

9、稳定性

确定产品的储存、运输条件，产品的保质期限。

10、一致性

验证产品的均一性。

十、常见问题解答

1、如何选用培养基？

选择培养基没有一定标准，有几点建议可供参考：

（1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅文献，或在购买细胞株时咨询。

（2）本单位惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。

（3）根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM。

（4）用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。

2、选择便宜的培养基品种成本就低吗？

（1）通常，培养基可以适合多种细胞，细胞也可以在不同培养液中生长；例如在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。

（2）培养基养份不同会导致细胞生长效果不同，病毒或蛋白表达不同，应该选择效果最好的培养基，考虑生物制品的综合成本；

（3）最终目的是追求生物制品的得率——得率高则成本低。

3、L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的，脱掉氨基后， L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。 但L－谷氨酰胺在溶液中不稳定，在高温下会分解成吡咯烷酮和羧酸，也有一些毒降解产物如NH4+会不可逆转地损坏细胞壁。

L-谷氨酰胺在不同温度、不同pH值条件下的稳定性研究如下。

4、为什么培养基中可以省去酚红？

酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂，研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），为避免固醇类反应，用无酚红培养基。

5、在新鲜培养基中添加了血清和抗生素后，有效期是多长？

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

6、为什么不要用碳酸氢钠调pH值？

如图所示，培养基pH值随着碳酸氢钠量的增加，呈抛物线增长，当碳酸氢钠加到一定量时，pH变化越来越小。而培养基的渗透压值随着碳酸氢钠量的增加，呈直线增长，碳酸氢钠量越大，渗透压值越大。

如果为了达到工作pH值仅加入少量的碳酸氢钠，而忽略渗透压，一来可能会达不到缓冲效果而引起细胞培养过程中pH值变化较剧烈，二来会使培养基成为低渗溶液，在培养细胞时易造成细胞膨胀破裂；如果为了达到工作pH值而加入大量碳酸氢钠，一来可能会难以达到期望的pH值，二来会使培养基成为高渗溶液，在培养细胞时易造成细胞萎缩。

生产中最好通过实验找到合适渗透压和pH值情况下的碳酸氢钠加入量。下面是DMEM(HED)和MEM培养基的碳酸氢钠与pH值、渗透压的曲线。

7、细胞生长质量很好，为什么病毒、蛋白表达量没有提高？

细胞生长质量高是高表达的必要条件。

采用细胞生产的疫苗是体外培养一定量的动物细胞并接种病毒，利用病毒在细胞内增殖，得到预期的病毒抗原，然后制成疫苗。细胞生长质量包括细胞密度和形态，没有好的细胞生长质量就不可能有高的表达量。

但要注意的是，细胞生长质量好、密度厚度大时候病毒接种量也应该相应增大，表达量才会提高，否则前期的高质量细胞培养就可能浪费了。

同时病毒、蛋白的表达、分泌在一定浓度下可能会饱和，因此如欲获得高表达，还须研究合适的收液时间和次数。

8、污染是培养基质量不好引起的吗？

（1）培养基不是无菌产品，但有菌落数量控制。

（2）培养基在使用前通过高压或过滤灭菌。

（3）防止污染应该注意以下事项：

A.从污染的源头开始

确认工作细胞库是否被污染：用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。

确认毒种工作种子批是否被污染：用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。

确认所用培养基及其添加成分（如小牛血清、NaHCO3等）是否被污染：用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。实际生产中，可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养，48小时即可观察有无污染。

一些单位在使用血清时候往往不经过过滤除菌处理便直接加入到培养液中，可能带来污染。

其它：高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证，确保灭菌和除菌效果；前者应在投产前及其后的每6个月进行验证，后者应在每次除菌前、后进行验证工作（至少应在除菌后进行一次）。

另外，应将有毒区与无毒区严格分开，并有各自独立的空气净化系统及孵室，有毒区对无毒区应保持相对负压，防止病毒对培养细胞（尤其是细胞库）的污染。

B.从GMP管理、SOP操作方面加强管理力度

每二周（或每周）对无菌操作室及洁净区域按GMP要求进行检测

人员的GMP管理和无菌操作强化培训

C.一些特殊情况

细菌的大小从0.1-700μm，为防止细小细菌的污染，过滤除菌应尽量采用0.1μm的滤膜或滤芯。

大面积污染时，应对所有设施、用具及操作环境进行彻底消毒。

9、如何消除组织培养的污染？

当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

（1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

（2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。

（3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

（4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。

（5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

（6）重复步骤4。

（7）在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否已被消除。

十一、培养基

培养基产品分为细胞培养基、平衡盐、细菌培养基产品。

（一）平衡盐（balanced salt solution，BSS）

1885年Sydney Ringer开发生理盐水发展而来，由无机盐、葡萄糖和水组成。平衡盐通常以其发明者命名，基本平衡盐溶液都是基于细胞需要钠、钾、钙、镁和磷酸盐这5种离子开发而来，只是在离子浓度和盐的形式上有所区别。

平衡盐的主要功能是维持细胞内外渗透压平衡、控制和维持酸碱平衡在生理范围之内、提供能量和代谢所需的无机离子。平衡盐培养基可用于配制培养用液基础液及细胞洗涤液。常用的平衡盐有：

1、Dulbecco,s平衡盐（D-PBS），不含碳酸氢钠；

2、Hanks,平衡盐（HBSS），含碳酸氢钠少，约0.35mg/L；

3、Earle,s平衡盐（EBSS），含碳酸氢钠多，约2.2mg/L；

4、PBS平衡盐，无Ca²⁺ 、Mg²⁺离子。

（二）细胞培养基

1、传统基础细胞培养基及其改良培养基

基础细胞培养基通常指基础合成培养基，主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。

据不同细胞和研究目的，选用合适培养基,还可补加新成分。如杂交瘤中常用DMEM加丙酮酸钠、2-巯基乙醇（相当于胎牛血清可透析组分的作用）。

合成培养基使用时加5-30%血清。

（1）199细胞培养基及其改良品种

1950年由Morgan等设计，除BSS外，含有53种成分，添加适量的血清后，可广泛用于多种细胞培养、病毒学、疫苗生产等。

199（HB）细胞培养基，主要应用于Vero细胞、地鼠肾细胞转瓶培养生产狂犬、乙脑等疫苗，具有高缓冲性能，能够有效提高病毒滴度。

改良199细胞培养基——199（HB）细胞培养基

狂犬疫苗生产实践证明，199（HB）细胞培养基与传统199细胞培养基相比，具有以下优势。

a)细胞生长形态好

用199（HB）细胞培养基培养的细胞生长速度相对较快，形态良好。

b)营养液的pH较稳定

用199（HB）细胞培养基配制病毒维持液pH值较稳定，经过3－4天的细胞培养后pH值变化小。

c)病毒原液滴度高

用199（HB）细胞培养基收获的病毒原液相对用199培养基收获的病毒原液平均滴度要高，尤其对二次苗的影响。

199（HB）培养基 199培养基

d)纯化后原液的效力明显提高

用199（HB）细胞培养基培养后，对纯化后原液的效力影响比较明显，对效力有明显提高。

（2）BME细胞培养基

基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），1955年由Eagle设计，BSS＋12种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM等。

（3）MEM细胞培养基

低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），1959年修改配方，删去赖氨酸、生物素，增加氨基酸浓度，适合多种细胞单层生长，是一种最基本、适用范围最广的培养基，是一种被广泛应用的培养基。

需要注意的是，MEM细胞培养基有含Earle’s平衡盐的类型，也有含Hanks’平衡盐的类型；有高压灭菌型的，也有过滤除菌型的；还有含非必需氨基酸的类型。生产和科研时，应根据实际情况注意选择合适的MEM细胞培养基。

另外，因MEM培养基营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。

（4）DMEM细胞培养基及其改良品种

DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）。细胞生长快。附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用于杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。

改良DMEM细胞培养基——DMEM（HED）细胞培养基

DMEM（HED）细胞培养基，培养CHO细胞生产乙肝疫苗，具有较强细胞维持能力，可增加收液次数，有效提高蛋白表达率。

生产和试验研究证明，DMEM（HED）细胞培养基在细胞生长和病毒分泌方面均优于使用DMEM细胞培养基。

a)使用DMEM（HED）细胞培养基细胞贴壁和长满单层时间明显快于传统DMEM细胞培养基，维持2个月细胞未出现脱落现象。

使用DMEM（HED）细胞培养基，在接种后第2天， 80％细胞已伸展并开始分裂增殖，第3天已长成较密单层，细胞贴壁均匀，形态清晰，呈多边形和梭形，细胞间略有空隙，细胞数为7.5 x 106个／ml。在此后转瓶培养的60 d内细胞数保持稳定，无明显增加和减少，无脱落，无明显形态变化，培养液中HBsAg滴度稳定在1：128～1：512之间。而使用传统DMEM细胞培养基，只有30％和40％的细胞伸展，至第4天才长成较密单层，小方瓶与双层转瓶结果相同。至30 d 时已长成较厚的复层，并开始大片脱落，细胞数明显减少，HBsAg滴度降低，最低降到1：32 。此后细胞开始重新贴壁、增殖，至45 d左右部分细胞长成单层，一部分细胞因脱落，至60 d时仍未能长满转瓶。

b)分泌HBsAg量明显高于传统DMEM细胞培养基组。

（5）IMDM细胞培养基

IMDM是由Iscove’s改良的Eagle培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。可用于杂交瘤细胞培养，以及无血清培养的基础培养基。

（6）RPMI-1640细胞培养基

Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS＋21种氨基酸＋维生素11种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养。

（7）Fischer’s细胞培养基

用于白血病微粒细胞培养。

（8）HamF10、F12细胞培养基

1963年、1969年由Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，F12适用于CHO细胞。

（9）DMEM/F12细胞培养基

DMEM和F12细胞培养基按照1:1比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。

2、低血清细胞培养基

血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是必不可少的。大部分的组织培养研究者非常熟悉血清添加物给予基本培养基配方的良好生长支持特征。然而，伴随血清的使用也带来了很多的问题。

费用因素

生产血清费用高而效率低。小牛血清还必须来源于没有疯牛病、口蹄疫和其它高度传染性疾病的地区。

差异

所有的血清都是一种成分不确定的混合物，血清批与批之间的组分存在差异。

传染源

动物血清有可能携带传染源，包括支原体、病毒和有毒物质。任何一种传染源可能对正在生长的细胞系或者制品带来风险。

法规问题

为了使与传染源相关的风险减少到最低，存在多个国家间进出口生物材料的国际法规。

为了解决这些问题，清大天一公司开发了多种营养培养基，以最小化和消除与使用动物血清相关的制品安全性问题。

（1）低血清细胞培养基的原理

通常在用传统培养基培养细胞时须加入约10％的小牛血清，低血清培养基是在基础培养基中添加了额外的营养成分，使小牛血清的添加量减少50％到70％，而对于细胞生长、增殖、形态和功能有较小或者没有影响。

（2）低血清培养基的优点

小牛血清是细胞培养液成本最大的原料，使用低血清培养基明显地节省培养液成本。

减少制品纯化损失，提高纯化收率，便于分离纯化。

减少由于不确定蛋白或者其它血清组分带来干扰和差异的风险。

提高制品安全性。

批间差减少或影响降低：

a)血清用量减少可以减少使用批次。

b)血清用量减少使得批间差的影响减少。

细胞在低血清培养基的生长相当或者优于加入10％小牛血清的传统培养基，没有观察到在细胞形态及增殖方面的显著差异。

（3）低血清细胞培养基的应用

VERO细胞、BHK21细胞等细胞在转瓶、微载体反应器中的培养。

5、无血清无动物组分细胞培养基

无血清无动物组分细胞培养基意指以该培养基配制的培养液无须添加牛血清即可培养细胞和维持生长收液，且该培养基成分中不含有任何动物来源成分。

在细胞培养生产生物制品过程中无须添加动物来源成分，避免疯牛病、口蹄疫等传播进入人体，减少人、兽在使用生物制品时的特异性免疫反应、降低产品成本（如降低培养液成本，简化下游纯化工作及提高产品收获量等）。采用生物反应器、无血清无动物来源成分培养基进行细胞培养制药是21世纪生物制药发展趋势；美国FDA和美国农业部已经严格控制在细胞培养中胎牛血清的使用。

同时，高密度细胞培养并长时间维持细胞密度是高表达率和高产量的关键，只能通过无血清悬浮培养技术来实现。

为了获得足够的营养成分，无血清无动物组分细胞培养基中氨基酸含量倍增，另外添加了生长因子和/或细胞因子，以及含有个别蛋白或大量蛋白的组分。

无血清无动物组分细胞培养基通常是特定细胞专用培养基，如无血清无动物组分CHO悬浮细胞培养基适用于CHO悬浮细胞。

6、替代天然培养基

培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分，所有的成分均有已知的化学结构。

（三）细菌培养基

细菌培养基为肺炎、流脑等细菌培养疫苗生产专用培养基。用于细菌性疫苗大规模生产中细菌体的培养及实验室中细菌体的研究培养。

目前细菌性疫苗生产厂家及实验室都使用自行配制的培养基进行细菌体的繁殖培养，由于配制工艺的不同、各种培养基组分来源不同，以及培养基中重要活性添加剂来源的质量不稳定性，导致了细菌体繁殖培养的数量和质量不稳定，批间差较大，结果时好时坏，该结果不仅给培养基使用者增加了成本，还严重影响了疫苗生产厂家的产量和质量，延误科研进程。

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细胞培养基本条件

1、合适的细胞培养基

合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。

2、优质血清

目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。

3、无菌无毒细胞培养环境

无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。

4、恒定的细胞生长温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。

5、合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。

细胞培养基种类与基本成分

细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。

1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质：

氨基酸

氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。

碳水化合物

碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。

无机盐

培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。

缓冲系统

大多数细胞所需pH 在 7.2 – 7.4。但是，细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 – 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 – 7.4)。

由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2 体系进行缓冲，因此，气相中的CO2 浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。如果气相或培养箱空气中CO2 浓度设定在5％，培养液中NaHCO3 的加入量为1.97g/L；如果CO2 浓度维持在10％，培养液中NaHCO3 的加入量为3.95g/L。

细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2 – 7.4 范围内具有较好的缓冲能力，但是非常昂贵，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L）共用，以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。大多数培养液中含有酚红作为pH 指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。

维生素

在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。

其它成分

在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。如在杂交瘤技术中常用的DMEM 培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞。2-Me 是一种小分子还原剂，极易氧化。分子量为78.13，纯的2-Me 是一种无色有刺激味的液体，比重为1.110-1.120(Do20)，常用终浓度为5×10-5M。常配制成0.1M 的储存液，用时每升培养液加0.5ml。

液体培养基保存：

液体培养基应于4℃冰箱避光保存，实验前放入37℃预热。未加血清液体培养基有效期为12 个月。液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。如果细胞生长不良，可以再添加适量L-谷氨酰胺。

干粉培养基保存：

4℃冰箱避光保存，有效期36 个月。

血清

细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。

血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细胞生长能力进行检测，然后再大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以下几点：

（1）需要长期保存的血清必须储存于-20℃ – 70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月。由于血清结冰时体积会增加约10％，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

（2）一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。

（3）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

（4）热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。

（5）切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量。

（6）血清中的沉淀物絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。

显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。

细胞培养环境

1、实验室设计

细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。

2、常用设施及设备

（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。

（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。

（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物

（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。

（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。

3、培养器皿

常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。常准备量是使用量的三倍。器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面几种。

（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml 等几种。

（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种。

（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。分直径30mm、60mm、120mm 等几种。

（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。常用1ml 和10ml 两种。短吸管也叫滴管，分弯头和直头两种。

（5）离心管：离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿，根据用途不同形态各样，常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类。前者分别为50ml、30ml、15ml；后者则多为10ml 和5ml。

（6）其它：如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。

4、细胞培养温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定而适宜的温度。不同种类的细胞对培养温度要求也不同。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1 小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1 小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1 小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1 小时，细胞全部死亡。相反，温度不低于0℃时，对细胞代谢虽有影响，但并无伤害作用；把细胞放入25－35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢；放在4℃数小时后，再回到37℃培养，细胞仍能继续生长。细胞代谢随温度降低而减慢。当温度降至冰点以下时，细胞可因胞质结冰受损而死亡。但是，如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂（二甲亚砜或甘油），可在深低温下如－80℃或－196℃（液氮）长期保存。

5、合适的气体环境

气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。

开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH 值。大多数细胞的适宜pH 为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长，如成纤维细胞最适合pH 是7.4-7.6。每种细胞都有其最适pH 值。

细胞培养无菌操作基本技术

无菌操作技术分为三个部分：工作环境及表面的处理，细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理及培养液与培养细胞的处理。

工作环境的处理

使用层流超净工作台是最经济有效的手段。超净工作台正常工作时，向下的气流可阻挡外界空气污染物进入超净台。

（1）实验前，无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60 分钟灭菌，用70% 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风机运转10 分钟后，才可开始实验操作。每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。实验结束后，将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用70% 酒精擦拭无菌操作台面，再让无菌操作台风机运转10 分钟后，才可进行下一个实验操作。

（2）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。

（3）小心取出无菌实验用品，避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手夾住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。

（4）工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐物品伤人等。

（5）定期检查下列项目：CO2 钢瓶内的CO2 压力；CO2 培养箱内的CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及HEPA 过滤器滤膜，预滤网﹙300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA）。

细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒

清洗

在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。因此对新使用玻璃器皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。

玻璃器皿的清洗

组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明无油迹，而且不能残留任何物质。

（1）浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。新瓶使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。

（3）浸酸：清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，其处理过程称为浸酸。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。清洁液去污能力很强。是清洗过程中关键的一环。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间一般为过夜，不应少于6 小时。 清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的下列三种： 重铬酸钾（g） 浓

硫酸（ml） 蒸馏水（ml） 比例如下

（A）强清洁液 63∶1000∶200000

（B）次强清洗液 120∶200∶1000

（C）弱清洁液 100∶100∶100。

清洁液配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。

（4）冲洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或洁液的残迹。冲洗最好用洗涤装置。即省力、效果又好。如用手工操作，则需流水冲洗十次以上，每天水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用。

胶塞的清洗

细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理，常规清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30 分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20 分钟，晾干备用。

塑料制品的清洗

塑料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。

消毒

细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常见的原因有操作间或周围空间的不洁，培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底。由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染。

消毒方法分为三类：物理灭菌法（紫外线、湿热、干烤、过滤等），化学灭菌法（各种化学消毒剂）和抗生素。

（1）紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器皿。紫外线直接照射方便、效果好，经一定的时间照射后，可以消灭空气中大部分细菌，培养室紫外线灯应距地面不超过2.5 米，且消毒进物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。紫外线可产生臭氧，污染空气，试剂及培养液都有不良影响，对人皮肤也有伤害，不宜近照射。

（2）温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。温热消毒时，消毒物品不能装得过满，以防止消毒器内气体阻塞而千百万危险，保证其内气体的流通。在加热升压之前，先要打开排气阀门排放消毒器内的冷空气，冷气空气排出后，关闭排气阀门，同时检验安全阀活动自如，继后开始升压，当达到所需压力时，开始记算消毒时间。

消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全，防止消毒及表皮意外事件发生。

常用物品消毒压力及时间：

培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃, 15 磅, 20 分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干热灭菌170℃, 4 小时。

（3）化学消毒法：最常见的是70%酒精及1‰的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。

（4）抗生素消毒：主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。

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生物工程皮肤能够经受住半速发射的子弹轰击，但无法抵御全速飞行的子弹

这种皮肤由成层的蜘蛛丝和实验室培育的人造皮肤结合而成

科学家培育的一种转基因山羊所产羊奶中含有与蜘蛛丝相同的蛋白质，使用“山羊蛛丝”编成的织物坚固度是防弹背心所用的凯夫拉尔纤维的4倍。在实验室，科学家将山羊蛛丝与生物工程手段培育的人类皮肤混合在一起，从而获得具有防弹能力的人造皮肤。

《新科学家》杂志报道称：“生物工程皮肤能够经受住半速发射的子弹轰击，不过，它的抗冲击力存在极限，子弹达到每秒329米这一全速时，子弹便穿透皮肤。”荷兰研究员加里拉-伊萨迪表示，这项蜘蛛丝研究计划被称之为“2.6克每秒329米”，以点22口径步枪子弹的重量和速度命名。此项研究的目标旨在用蜘蛛丝蛋白取代人类皮肤中的角蛋白。

研究使用的蜘蛛丝在美国犹他州生产，而后在韩国纺成线，随后在德国编织成织物。最后一个步骤是让防弹皮肤周围生长出一层真正的皮肤，整个过程历时大约5周。伊萨迪指出，这项研究让科幻成为现实。蛛丝用于战争拥有悠久历史，成吉思汗就曾为所有骑兵配备蛛丝背心，抵御敌人射出的箭。

她说：“想象一下，利用蜘蛛丝制成的一件防弹背心，能够经受住子弹冲击并将子弹俘获——子弹相当于成吉思汗时代的箭的现代版。现在，让我们再往前迈进一步，为什么只制造防弹背心呢？想象一下，用蛛丝蛋白取代皮肤中的角蛋白。这种蛋白质与皮肤的坚韧性有关。”

伊萨迪称：“将蜘蛛分泌蛛丝的基因植入人类基因组的可能性也是存在的，从而打造出防弹人。听起来很科幻？也许吧，但我们认为能够让这种打造超人的想法成为现实，方式就是将具有防弹性能的蜘蛛丝与人工培育的皮肤结合在一起。”防弹背心已经有几十年历史，但能够防弹的皮肤却一直存在于科幻作品中，最著名的例子就是超人这位刀枪不入的超级英雄。

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《新科学家》网站相关报道（英文）

Bulletproof skin stops a speeding gunshot

What if your skin could resist a speeding bullet? Now a new futuristic tissue designed by artist Jalila Essaïdi, which reinforces human skin cells with spider silk, can stop a whizzing projectile without being pierced. Although its threads may look fragile, a spider-silk weave is four times stronger than Kevlar, the material used in bulletproof vests.

In the first clip, the bioengineered skin cushions a bullet fired at half speed. But its resistance has its limits: when shot at a full speed of 329 m/s, the bullet pierces the material and travels through it. The same tests were also performed with piglet skin, human skin and human skin fused with regular silkworm silk, which were all penetrated by bullets of both speeds.

An international team worked together to create the new material. First, transgenic goats and silkworms equipped to produce spider-silk proteins spun out the raw material in the synthetic biology lab at Utah State University. The cocoons were then shipped to South Korea, where they were reeled into thread, before being woven into fabric in Germany. The modified silk was then wedged between bioengineered skin cells developed by biochemist Abdoelwaheb El Ghalbzouri at the Leiden University Medical Center in the Netherlands. After five weeks of incubation, the hybrid skin was ready for target practice.

In addition to exploring the material artistically, Essaïdi is also looking into practical uses, such as skin transplants. Spider silk is already being developed by other teams for high-tech applications, which range from artificial corneas to brain implants.

For more about spider silk spin-offs, check out our full-length feature: “Stretching spider silk to its high-tech limits”. Or you might also like to find out about the science behind a lavish golden spider-silk cape, currently on display at the Victoria and Albert Museum in London.

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生命的起源一直都是科学家们研究的焦点课题，目前普遍认为生命起源于海洋，但是来自美国NCBI，德国奥斯纳布吕克大学等处的研究人员2月14日发表了题为“Origin of first cells at terrestrial, anoxic geothermal fields”的文章，通过分析细胞关键离子的比例，指出了细胞离子浓度的问题，从而提出海洋不具备细胞生成的成分要求，反而是内陆很可能是起源地。相关成果公布在美国《国家科学院院刊》（PNAS）杂志上。

文章的通讯作者之一是一位具有传奇色彩的科学家Eugene V. Koonine，这位进化生物学家在1980年代末就开始发表了一系列卓越的研究成果，90年代从莫斯科来到了美国，并扎根于NCBI(美国国立生物信息中心)，这里的数据库丰富，还汇聚了全世界的绝大部分的生物分子信息，Koonine教授通过分析整理这些数据，发表了连续的从分子生物学和进化角度阐明生命进化之树的卓越的优秀论文。

关于生命的起源，目前普遍认为起源于海洋，这一理论认为大约在45亿年前，地球就形成了。大约在38亿年前，当地球的陆地上还是一片荒芜时，在咆哮的海洋中就开始孕育了生命——最原始的细胞，其结构和现代细菌很相似。大约经过了1亿年的进化，海洋中原始细胞逐渐演变成为原始的单细胞藻类，这大概是最原始的生命。

但是在这篇文章中，研究人员分析了细胞的化学成分，指出所有细胞中含有的钾，磷和过渡金属的含量，都比现代海洋（或者重构原始海洋），湖泊，以及河流中的含量高得多，而细胞是通过一种成熟的，依赖于能量的膜蛋白酶保持内部离子的浓度。首个生成的细胞即没有能锁定离子的细胞膜，也没有膜蛋白泵，那么只能与环境保持平衡了。

因此研究人员认为现代细胞中的离子构成也许反映了原型细胞（protocells）起源地的无极离子构成。从而研究人员就尝试重构首个细胞生成的“孵化地”，他们发现原型细胞很可能是在内陆装配起来的，在类似于今天的黄石国家公园的地热区里，火山活动把来自地球内部的蒸汽释放出来，这些排放的化学成分最符合细胞的无机化学组成。

研究人员提出如果这种由火山喷发而形成的蒸汽在附近合适的陆地中凝结，形成水塘，那么就有可能孵化出首个原型细胞。

生命起源研究十分有趣，也是科学家们孜孜以求的一个重要研究方向，近期除了上述研究研究之外，来自英国约克大学的研究人员还重构了DNA中糖分子，解析了DNA中糖分子是如何重建的。

研究人员发现使用简单的左手形式氨基酸可以催化糖类形式，最终产生显著的右手形式糖分子。这将能够解释碳水化合物如何形成以及右手形式分子为什么在自然形态中占主要地位。 （来源：生物通 张迪）

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PNAS发表论文摘要（英文）

Origin of first cells at terrestrial, anoxic geothermal fields

Armen Y. Mulkidjaniana,b,1, Andrew Yu. Bychkovc, Daria V. Dibrovaa,d, Michael Y. Galperine, and Eugene V. Koonine,1

Abstract

All cells contain much more potassium, phosphate, and transition metals than modern (or reconstructed primeval) oceans, lakes, or rivers. Cells maintain ion gradients by using sophisticated, energy-dependent membrane enzymes (membrane pumps) that are embedded in elaborate ion-tight membranes. The first cells could possess neither ion-tight membranes nor membrane pumps, so the concentrations of small inorganic molecules and ions within protocells and in their environment would equilibrate. Hence, the ion composition of modern cells might reflect the inorganic ion composition of the habitats of protocells. We attempted to reconstruct the “hatcheries” of the first cells by combining geochemical analysis with phylogenomic scrutiny of the inorganic ion requirements of universal components of modern cells. These ubiquitous, and by inference primordial, proteins and functional systems show affinity to and functional requirement for K+, Zn2+, Mn2+, and phosphate. Thus, protocells must have evolved in habitats with a high K+/Na+ ratio and relatively high concentrations of Zn, Mn, and phosphorous compounds. Geochemical reconstruction shows that the ionic composition conducive to the origin of cells could not have existed in marine settings but is compatible with emissions of vapor-dominated zones of inland geothermal systems. Under the anoxic, CO2-dominated primordial atmosphere, the chemistry of basins at geothermal fields would resemble the internal milieu of modern cells. The precellular stages of evolution might have transpired in shallow ponds of condensed and cooled geothermal vapor that were lined with porous silicate minerals mixed with metal sulfides and enriched in K+, Zn2+, and phosphorous compounds.

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1.如何选用培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养 基（SFM）。

2.为什么要热灭活血清？
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

3.L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？
GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。

5.为什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞？
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7.如何消除组织培养的污染？
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。

例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2－3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2－3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4－6代，确定污染是否以已被消除。

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.Hank’s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank’s 平衡盐溶液（HBS）和Earle’s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌体检验
生物化学检测
激素的检测
血红蛋白检测
Sf9 细胞生长促进及方法学检测

11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？
二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

12.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗？
是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800μl）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。

13.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好？
如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。

14.如何检测内毒素(热源)水平？
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎（Limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。
胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）

15.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗？
如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。

16. 20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？
对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。
下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况
例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-（2×0.310）＝6.78

17. 室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？
缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。

18. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？
生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0－6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345－380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。

19. High Five细胞有任何其它名称吗？
High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？
High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five细胞用多大的密度冻存？
3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。

23.如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？
我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。
胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：
1)去除培养基。
2) 用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS.
3) 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。
4) 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）
6) 离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。
7) 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

24.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。

25.如何评估ES细胞合格的胎牛血清？
使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。
相关生长效率分析：
当ES细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。
细胞毒分析：
当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。
相关形态学和分化分析：
检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。
所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。）
经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。

26.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。

请问在平常的细胞生物学实验中用的磷酸缓冲液常在6.0、6.5、6.8等等这样的范围，常常因为温度等原因，PH值发生了变化，而用PH计又不易测得。这种情况怎么办？如果实验也同样能进行，那么为什么还要规定这么几种值，直接就写在PH值是6－7之间就好？我很困惑，答：

1、在细胞生物学实验中的磷酸缓冲液的PH的确有不同的规定，如6.0、6.2、6.5、6.8等，这些规定是在室温条件下的PH值，在实验过程中，PH值会随温度的变化而变化，但一种缓冲液在不同温度下，缓冲能力是不会改变的；
2、我个人的经验，在细胞生物学实验上，磷酸缓冲液PH的不同，主要是许多前辈的经验值，也是实验最佳效果值，我们在实际工作中，PH值有一些偏差，实验也能成立，但达不到最佳效果；
3、在配制缓冲液时，一定要确保室温下的准确PH值，如果温度不是室温，可以使用温度校正表，来确定实际的PH值，用便携式PH计可随温度不同自动校正。

细胞的原代培养

一、原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
二、仪器、材料及试剂
仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）
材料：胎鼠或新生鼠
试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒
三、操作步骤
（一）胰酶消化法
1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
（二）组织块直接培养法
自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。

入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
四、注意事项
1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
五、无菌操作的几个注意事项
1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。
2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。
附：Hank’s液配方：
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4•H2O 0.06g，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。

细胞支原体污染的荧光检测方法

DNA萤光染色法

·原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine(A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。

·测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。

·待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。

·特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。

·缺点：有时仍会有萤光背景，影响判读。

材料︰·Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014﹚、

bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、

02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。

·Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。αMEM with 10%FB( medium for Vero cell)配制试剂:

·无菌HBSS︰配制Hanks’ balanced saltsolution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。

·Hoechst 33258 stock solution（100X）︰称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。

·Hoechst 33258 working reagent︰取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。

·mounting solution︰22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。

·固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。 步骤：

·培养Vero细胞： Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。

·在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2×10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。

·接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。

·将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的萤光染色观察。

·以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液,负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM +10%FBS)。 DNA萤光染色检测︰

·取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。

重复上述之步骤，风干10分钟。

·于每个well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30 min。

·吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。

·以100x-400x萤光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330～380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。 结果判读︰若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其萤光可维持数星期。图例 (A)为negative result : 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result : 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。 (A)Negative result 萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。 (Positive Result 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。

有关血清使用过程中的问题

一．有关血清的问题,我们整理了一些实验室里常会遇到的问题,供参考:
1.保存血清最好的方法?
我们建议血清应保存在-5℃—20℃.若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻.
2.如何解冻血清才不会使产品质量受损?
我们建议您将血清从冷冻箱取出后,先置于2—8℃冰箱使之溶解,然后在室温下使之全溶.但须注意的是,溶解过程中必须规则地摇晃均匀.
3.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,如何处理?
血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一.但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量.欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤.我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状物,因为它可能会阻塞您的过滤膜.
4.何谓热灭活?有无必要?
一般以56℃、30分钟来处理已解冻的血清,因为此加热步骤,可以使补体去活化,而补体所参与的反应有:溶细胞活性,平滑肌的收缩,肥大细胞和血小板组胺的释放,增强吞噬作用,淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活.
实验显示,即使对血清进行正确的热灭活处理,对大多数的细胞而言也是不需要的.经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低.而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是”小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者认为是微生物的分裂扩增.因此我们建议您,若非必须,您可以不需要做热处理这一步.如此一来,不但节省您宝贵的时间,更确保您的血清的质量.
5.如何避免沉淀物的产生?
我们建议您在使用血清的时候,注意正确的血清解冻步骤,并尽量避免灭活血清及长时间的将血清置于高温环境中.

二．随着疯牛病和变异性克雅氏病的出现，以牛血清制作培养基生产的疫苗会不会传播疯牛病，成为人们关心的问题。

国外权威部门对此的意见是：没有任何证据表明接种疫苗可以传播疯牛病；没有任何证据证实疫苗受到可导致疯牛病的物质的污染；疫苗所用牛血清只在生产的初期阶段用于制作培养基，在成品中该成分已经被稀释为痕量；疫苗传播疯牛病的危险性只是概率极低的理论假说。据外电报道，为确保接种疫苗安全，美国食品与药品管理局(FDA)生物评估和研究中心(CBER)去年专门召开了可传染性海绵状脑病咨询委员会和相关生物制品咨询委员会的联合会议。会议听取了相关研究报告后认为，疫苗传播变异性克雅氏病的可能性是4000万剂分之一至400亿剂分之一，可以说是微乎其微，目前没有任何证据表明接种疫苗制品会发生问题。关于疫苗与牛原材料的任何危险性的猜测只是基于许多假想，没有一个可以确切地量化。

今年，国外变异性克雅氏病监测机构的专家对接种疫苗与发生变异性克雅氏病的关系进行了分析。他们根据疯牛病确诊时间及潜伏期推算，认为如果接种疫苗与传播变异性克雅氏病有关，1981年以前出生的人就不应受到感染。但事实上他们分析的52例患者有49例出生在1980年以前，其中半数以上生于1970年前。此外，目前发现的变异性克雅氏病病例绝大多数发生在英国，而疫苗在全世界范围内广泛使用。

因此，他们在权威杂志《疫苗》上发表文章提出，无论从变异性克雅氏病的发病时间还是地理分布分析，均无法证实疫苗传播疯牛病的假说。

发现首例疯牛病的布瑞德利爵士，近年已对疯牛病与变异性克雅氏病的相关性进行了大量研究。他将疯牛的血液和其他体液及器官组织直接注入试验动物，让试验动物大量食入疯牛的脑组织，结果发现在牛与牛间传染没有障碍。在小鼠身上造成感染的是疯牛的神经系统组织，而血液、淋巴、骨髓、牛乳及牛脾、胰等都没有造成感染。这个结果得到了世界卫生组织、欧洲药物评审委员会、美国FDA和美国疾病控制中心(CDC)的认同。

如何面对疫苗可能导致海绵状脑病的理论假说，美国公共卫生部门(PHS)建议继续推荐免疫程序，接种常规疫苗。欧洲药物评审委员会在今年2月28日发表了《关于在疫苗生产中使用牛原性材料发生牛海绵状脑病危险性评估的公开声明》，声明说：接种疫苗的益处远远大于疯牛病污染的假设性危险，如果公众对接种疫苗的信心受到破坏而导致免疫接种率降低，将会导致严重危害甚至导致致死性疾病的重新流行。据悉，我国病毒研究、生物制品和疾病控制部门的学者也持此观点。

三．血清解冻后发现有絮状

血清中沉淀物的出现有许多原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性造成的；而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管中，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

四．细胞培养中的支原体污染

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。它不同于细胞，也不同于病毒。支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，营养要求比细菌高。支原体的种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。

细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是个世界性问题。国内外研究表明，95％以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）和莱氏无胆甾原 （A.laidlawii），为牛源性。

以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群，但能够污染细胞的支原体种类是很多的，国外调查证明，大约有二十多种支原体能污染细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体。

支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染（一些支原体在人体是正常菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

组织细胞培养工作中，主要从以下几个方面来预防支原体的污染：控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支原体，常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，一般来讲，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如 -内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺药物普遍耐药。

对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮；其他类抗生素如氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小抑制作用，所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂。InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。

五． 血清热灭活―您是否在浪费时间？

血清的热灭活是很多培养者感兴趣的话题，价格不菲的血清中含有诸如生长因子，维生素，氨基酸等珍贵物质，而将它们置于50℃以上的温度长达30分钟是完全没有必要的。尽管如此，在大多数实验室之中血清的热灭活还是作为常规来执行，多数实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子，氨基酸等成分带来的负面影响，在我们的技术热线中最常被提到的就是否该对血清进行热灭活，下面我们就对胎牛血清的热灭活进行一些探讨和解释。

根据调查，至少70％的研究者对血清的灭活仅仅是因为遵照常规操作，或者说认为是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间,而时间则从15分钟到60分钟不等.其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要。Triglia和Linscott［1］曾对商业胎牛血清中的补体成分进行测定，他们发现胎牛血清中含有的C1，C6仅达成年动物血清的1-3%，而其它补体成分仅有成年动物的5-50％，至于补体的主要成分C3在胎牛血清中则几乎不能检出。通过补体固定实验，我们也在多个不同批次的胎牛血清中获得了相似的结果。即使是在未稀释的血清中，也未发现有明显的溶血现象。另外，多数实验室在培养前将培养液进行预热的过程，也对热敏的补体有灭活的作用。

在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。多年以前，450纳米孔径的滤膜被用于加工血清时，血清中支原体的污染时有发生。针对这个问题，HyClone首家使用100纳米三层滤膜连续滤过技术，自从采用这项技术以及后来的40纳米滤过技术之后，我们的血清产品中没有再发现有支原体的污染，也是使得热灭活成为不必要的另外一个原因。

Pinyopummintr等证明血清去除灭活步骤不影响牛胚胎的发育分化［2］；有研究结果［3］证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用，在用SV-BHK、BALB-3T3、CV－1、FS-4细胞对细胞粘附实验中，热灭活对胎牛血清的影响小于对小牛血清的影响。

我们调查了热灭活对胎牛血清以及对其中不同细胞株生长能力的影响。通过比较11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株（HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5）的生长带来负面影响，三个细胞株（FOX-NY，MDCK和CHO-K1）不受热灭活的影响，而只有两个细胞株（Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid），在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。

在正常操作下，热灭活经常给血清产品带来负面的影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，而导致的沉淀又常常被认为是微生物的污染。注意到这个现象之后，为了验证污染的存在，或者促进沉淀的溶解，许多培养者往往将血清放置37℃温育。

这却往往使情况变得更糟，血清中的蛋白进一步的析出，为了确信血清未被污染，进行的镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验更是浪费了实验者大量的时间和精力。

总之，多数细胞培养中血清的热灭活并不是必要的。很多场合下，热灭活并不会改善细胞的生长，却降低了支持细胞生长的能力。即使在少数有促进的情况下，其促进的比率也是微不足道的。另外，血清的热灭活导致的沉淀常常被认为是微生物的污染，从而给用户和供应商都带来不必要的麻烦。我们建议，对于那些对血清进行灭活的用户，需要通过试验来证实其必要性，确定灭活的适当条件；在灭活过程中，需要严格认真监测，并选择一个可重复的方案进行操作。

参考文献：

1. Triglia, R.P., Linscott, W.D. 1980. Titers of nine complement components, conglutinin and

C3binactivatorinadult and fetal bovine sera. Mol. Immunol. 17:741-748.

2. Pinyopummintr, T., and Bavister, B.D. 1994.Development of bovine Embryos in a Cell-Free

Medium – Effects of Type of Serum, Timing of its Inclusion and Heat Inactivation.

Theriogenology. 41:1241-1249.

3. Giard, D.J. 1987. Routine Heat Inactivation of Serum Reduces its Capacity to Promote Cell

Attachment. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 23:691-697.

《Art to Science》Vol.15 NO.1,1996
Hyclone-Pierce 沈阳总代理公司

六．血清中的“小黑点”现象：血清在经过一段时间的低温冻存再融解后，在正常情况下会出现絮状蛋白沉淀。但往往有用户反应血清中有“小黑点”现象，认为是微生物污染。实验发现血清在37℃环境放置时间过长或经过加热灭活处理，血清中的沉淀物往往会呈增多趋势，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，让使用者误以为是血清遭受微生物污染并在分裂增殖。因此如无必要，完全可以不进行热灭活处理并保证血清的低温保存。

七． 牛血清在细胞培养中对细胞的生长增殖具有重要甚至是难以替代的作用，它含有丰富的细胞生长必须的营养成分。主要有以下成分和功能：

1、 血清中的主要物质—蛋白质如白蛋白等具有缓冲细胞培养液酸碱度、维持渗透压的作用。

2、 转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白等结合蛋白，有识别维生素、脂类、金属和其它激素等，并能与有毒金属和热原质结合，从而起到解毒作用。

3、 纤维粘连素、胎牛血清中的胎球蛋白、贴壁因子等能促进细胞贴壁、铺展。

4、 多肽类如血小板促生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子、胰岛素、类胰岛素生长因子、促生长激素、氢化可的松等能支持细胞分裂增殖并维持细胞对数生长。

5、 2巨球蛋白等蛋白酶抑制剂能抑制蛋白酶，保护细胞不受损害。

6、 血清中还含有丰富的氨基酸、葡萄糖、酮酸及与蛋白相结合状态的微量元素等，对细胞培养均有意义。

八． 微生物污染的排除

细胞受各种霉菌、细菌和支原体污染后，一般都较难排除或杀灭，其中以支原体更难排除，因此从预防着眼为上。

1） 抗生素除菌法：用BM－1（截耳素衍生物）和BM－2（四环素衍生物）抑制支原体

1．抗生素制备:均可用PBS配成250×浓缩液－20℃备用,使用浓度参考《组织培养和分子细胞学技术》117页表6－2。

2．处理：取受支原体污染的细胞，吸除培养液，加入含BM-1的1640培养液培养3天后，吸除培养液，再加入含BM-2的1640培养液培养4天，如此连续三个轮回。

3．检测：用33258荧光染色镜检（每个轮回末应检测一次）。

4．培养：清除支原体后的细胞，在不加上述抗生素的培养液中，再传代培养3～4次。

5．镜检：如清除不彻底可再进行处理至纯净为止（一般3个轮回即能被完全消除）。BM-1和BM-2与CIP（4-氟，2-羟基喹啉）联合应用亦可，即先用含BIP培养液培养12天后，再按上述方法处理。

2） 加温除菌法

把受污染的细胞置41℃中作用5～10小时。

3） 动物体内接种除菌法

把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

4） 巨噬细胞吞噬法

从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止

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